Oven de moederstof van het z.g. Skatolrood in normale menschelijke urine. ca ca ca ca ca ca J. Pij. 5TAAL. Over de moedersfof van fyef z.g. Skafolrood in normale menschelijke urine. t=i e=i t=i Over de moederstof van het z.g. Skafolrood in normale menschelijke urine. ca ca ca ca cs ca PROEFSCHRIFT ter verkrijging van den graad van Doctor in de Geneeskunde aan de Rijks-Universiteit te Utrecht, na machtiging van den Rector Magnificus Dr. F. R. F. C. Went, Hoogleeraar in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, volgens besluit van den Senaat der Universiteit tegen de bedenkingen van de Faculteit der Geneeskunde te verdedigen op Donderdag 21 September 1905, des nam. ten 4 ure, door JOHONNES PHILIPPUS STARL, flrts te Utrecht, geboren te Utrecht. ARNHEM Firma G. W. VflN DER WIEL X Co. 190 5. flan mijne Vrouw. Allen, wier leiding of omgang tot mijne vorming hebben bijgedragen, irensch ik bier mijnen hartelijken dankte betuigen. Vooral aan U, Hooggeleerde Pekelharing, Hooggeachte Promotor, geroet ik mij ten zeerste verplicht, zoowel voor den zeer gewaard eerden , steeds zoo bereidwillig gegeven, raad en steun, als voor de belangstelling, die Gij gedurende het geheele onderzoek in mijn werk hebt getoond. Kn evenzeer gevoel ik mij tot dank verplicht aan U, Hooggeleerde van Romburgh , die steeds Uwe tijd en kennis tot mijne beschikking steldet en gastvrij mij den toegang tot Uw laboratorium verleendet. En het zal U niet verwonderen, Hooggeleerde Tai.ma , dat Gij, tot wien ik als assistent in nauwere betrekking heb gestaan, in mijne herinnering eene bijzondere plaats blijft innemen. I. Verschillende onderzoekers hebben in de laatste vijftig jaren in normale of pathologische urine roode kleurstoffen gevonden of op eenvoudige wijze daaruit kunnen verkrijgen, zonder dat daardoor omtrent den aard der kleurstoffen of hare chromogenen in liet algemeen voldoende kennis is verkregen. De beschreven kleurstoffen waren meestal onzuiver; waarschijnlijk zullen dezelfde kleurstoffen of mengsels van kleurstoffen door verschillende onderzoekers zijn gevonden en van verschillende namen zijn voorzien. De namen geven ook weinig inzicht. Voor een gedeelte zijn de benamingen uit twee componenten samengesteld, waarvan de eene component op de afkomst uit urine en de andere op de roode kleur wijst, zooals de urorose'ine van Nencki en Sieber '), de urrhodine van Heller -), de urorubine van Plosz 3); voor een ander deel zijn die kleurstoffen in de litteratuur bekend onder den naam van haren ontdekker, zooals de kleurstof van Leube 4). van Thormiilen 5). ') Journ. f. prakt. Ch. 1882. N. F. XXVI pag. 333: Ueber das llroroseïn. a) Heller's Arch. 1845. pag. 161, 1846. pag. 19, 536, 639 : Uebcr die Farb stoffc des Harns, gecit. bij Neubauer u. Vogel, Harnanalyse, 9 Aull 1890. pag. 96. 3) Z. f. Physiol. Chemie VI pag. 604: Ueber einen neuen farbigen Harnbestandtheil en Z. f. Physiol. Ch. VIII pag. 85: Ueber einige Chromogene des Harns u. deren Derivate. '•) Vircliow's Arcli. CVI pag. 418: Ueber einen neuen path. Hamfarbstoff. 5) Vircliow's Arcli. CVIII pag. 317 : Mittheilungen über einen noch nicht bekannten Körper in path. Menschenharn. Onder de verschillende uit urine verkregen roode kleurstoffen hebben vooral twee in het bijzonder de belangstelling opgewekt, n.l. het indigorood (met zijne modificatie : het indigoblauw) en liet z.g. skatolrood, vooral ook, omdat men ze als eenen maatstaf beschouwde bij de beoordeeling der rottingsverschijnselen in den darm. Van deze beide kleurstoffen is het indigorood (resji. blauw) en zijn chromogeen goed bekend. Dit chromogeen is ook uit urine bereid kunnen worden door Baumann en Brieger '), die tevens aantoonden, dat dit chromogeen, tot dusverre urine-indican geheeten en identisch met planten-indican gedacht., niet zooals dit een glycosied is, maar een zuur, dat bij behandeling met HC1 zwavelzuur afgeeft. Analyses deden dit chromogeen kennen als indoxylzwavelzuur, analoog aan andere, door Baumann in urine aangetoonde, gepaaide zwavelzuren van aromatische verbindingen, liet indoxylzwavelzuur bleek zoowel indigoblauw als indigorood te kunnen leveren en dank zij eene rijke litteratuur (Rosin, "Wang, Maillard. Bouma, Ellinger e.a.) over dit onderwerp, bestaan omtrent de hoofdzaken geene meen ingsversch i llen meer. Van de tweede kleurstof, het z.g. skatolrood, dat zich van het indigorood duidelijk onderscheidt door zijne onoplosbaarheid in chloroform, kan niet hetzelfde worden gezegd. Wel wordt na de ontdekking van het skatol aan eene bepaalde kleurstof uit urine de naam skatolrood gegeven en skatoxylzwavelzuur als het chromogeen beschouwd, maar toch heeft men tot nog toe geene zekerheid hieromtrent verkregen, niottegen- J) Z. t. Physiol. Ch. III pap. 254 : Ueber IndoxylschwefelsRure, das Indikan des Harns. staande bedoelde urinekleurstof in bereidingswijze en eigenschappen overeenkomst vertoont met eene roode kleurstof, die uit skatolderivaten is te verkrijgen. De geschiedenis van de/.e kleurstof en van skatol valt echter geheel samen. Het skatol werd door Brieger ') onder de distillatieprodukten van menschelijke faeces ontdekt. Toen hij ïi.l. het distillaat uit met azijnzuur zuur gemaakte faeces, na neutralisatie, met aether uitschudde en van deze aetheriscbe oplossing den aether afdistilleerde, bleef een olieachtig residu over, dat door koken met water, bij afkoeling, de nieuwe stof liet uitkristalliseeren. De kristallen hebben faecalen reuk, smelten bij 94 a 95° C. en lossen moeilijker in water op dan indol. Met HC1 en choorkalk geven zij geene roode kleur; rookend HN03 veroorzaakt in de waterige oplossing eene witte troebelheid. In faeces van honden en van typhuslijders beeft hij nooit skatol gevonden. Na subcutane injectie van skatol bij konijnen, verschijnt in de urine een chromogeen, dat met HC1 en chloorkalk eene roode of violette kleur geeft. Door analyse en bepaling der dampdichtheid vindt Brieger2) als moleculairformule: C9 H9 N, overeenstemmende met de door Nencki3) bepaalde samenstelling. Na subcutane injectie van skatol bij konijnen en kikkers vindt hij in de urine eene vermeerdering van het gepaarde zwavelzuur. Het gelukte hem skatol te verkrijgen door rotting ') Ber. d.d. chem. Ges. X pag. 1027 : Ueberdie fliichtigen Bestandtheile der menschl. Excremente. ') Ber. d.d. ch. Ges. XII pag. 1985: Ueber Skatol. a) Journ. f. prakt. Ch. 1879. N. F. XX pag. 466: Die empirische Formel des Skatols. van bloedeiwit. Ook Nencki1) had het reeds verkregen door rotting van vleesch en pancreas. Langzamerhand bleek het ecu constant rottingsprodukt van eiwit tc zijn: E. en II. Salkowski2) verkregen het inwisselende hoeveelheden bij rotting van vleesch; Ncncki3) bij rotting van runderhersenen; Brieger 1) bij rotting van fibrine, kippeneiwit, lever, caseïne. Het kon nu ook gemakkelijker worden aangetoond, omdat Brieger 4) in het pikraat een middel vond om het van indol tc scheiden. Gebruik makende van de gelegenheid om skatol in grootere hoeveelheid te l)ereiden, gaf Brieger 1) aan een hond in dagen c" 7 gr. skatol. De hoeveelheid gepaard zwavelzuur der urine was daarna ca 4 maal zoo groot als vóór de proefneming. Ilij beproefde toen, op analoge wijze alsBaumann en Brieger8) het indoxylzwavelzuur uit urine hadden bereid, de verbinding af tc scheiden, waarin het skatol in de urine was overgegaan. Hij verkreeg slechts enkele kristallen, die in een droog reageerbuisje verhit, roode dampen leverden, terwijl het residu niet Ba€l2 een praecipitaat van BaS04 gaf. Ook de waterige oplossing der kristallen gaf na koken met HCl, waardoor eene roode kleur ontstond, met BaCl, een praecipitaat van BaS04. Hij vond hierin reden genoeg om aan te nemen, dat het skatol ' Journ. 1. prakt. Ch. 1879. N. F. XX pag. 4-66: Die empirische Formol des Skatols. *) Ber. d.d. Gh. Ges. XII pag. : Weitere Beitrage z. Kenntniss der Faiilnissprodnkte des Kiweisses. 3) Z f. Physiol. Ch. IV pa?. 371 : Z. Kenntniss der Skatolhildung. ',v Z. f. Physiol. Ch. IV pag. W 'w Weitere Beitrage z. Kenntniss desSkatols. 5) Z. i. Physiol. Ch. III pag. 254 : LTeher Indoxylschwefelsüure, das lndikan des Harns. als skatoxylzwavelzuur met «Ie urine werd uitgescheiden. De, door koken met HOI uit de onzuivere produkten dezer bereiding verkregen, roode kleurstof' scheidde zich hij afkoeling af. Zij is onoplosbaar in aether en water, oj)losbaar in alkohol. Hij verdamping van den alkohol verandert zij in eene bruine amorphe kleurstof, die onoplosbaar is in alkohol, aether en water. Met zinkstof verhit geeft de kleurstof den reuk van skatol. Analyses vau de kleurstof leverden geene overeenstemmende resultaten. Een paar jaren later (4884) deed Otto ') eene interessante mededeeling: Het was hem gelukt uit de urine van oenen diabeteslijder skatoxylzwavelzuur af te scheiden. Dit is de ecnige maal. dat uit urine skatoxylzwavelzuur kon worden bereid. Bemerkende, dat de urine vau den diabeteslijder rijk was aan skatolroodehromogeen en aan gepaard zwavelzuur, deed hij eene poging «mi volgens Brieger's methode het skatoxylzwavelzuur te bereiden en wel met gunstig resultaat. Eéne N-bepaling en twee H2S04-bepalingen gaven resultaten, die goed overeenstemden met de formule: C9 Hu N O S 03 K. Op deze bepalingen steunt hij zijne conclusie, dat de gevonden stof werkelijk skatoxylzwavelzuur is. waartegen m. i. nog wel iets zou zijn in te brengen! De eigenschappen der gevonden stof kwamen overeen met hetgeen Brieger had medegedeeld. Skatolearbonzuur kon hij niet uit deze urine verkrijgen; wel een bruine olie, die na 14 dagen rotting naar skatol rook, maar wier hoeveelheid te gering was om analyse toe te laten. Deze olie gaf met rookend i) l'iliiyrer's Arch. XXXIII pap. *>07: Das Vorkommen grosser Mengen von Indoxyl- u. Skatoxylschwefelsilure iin llarne bei Diabetes mellitus. UNO, eene roode kleurstof. Reeds Brieger ') cii Salkowski J) hadden l>ij eiwitrotting eene dergelijke bruine olie aangetrollen. Eene belangrijke bijdrage tot de kennis der skatolverbindingen brachten de onderzoekingen van E. en H. Salkowski -1). Verschillende eiwitsoorten werden bij alkalische reactie en zoo noodig na toevoeging van voeilingszouten in gesloten kolven door rioolmodder tot rotting gebracht. Na alloop der rotting werd het daardoor verkregen produkt aan distillatie onderworpen. Onder de talrijke vluchtige ontlediugsproducten vinden zij: indol, skatol. en eene bruine stinkende olie. die met HN02-vrij IINO, eene roode kleur gaf. In dit opzicht wijkt dus deze olie af van de reeds hoven beschreven olie. Ook in het. na distillatie overgebleven, residu bleek nog een skatolderivaat aanwezig te zijn. (z. pag. 7.) Niet alle eiwitsoorten geven dezelfde hoeveelheden indol en skatol. Zoo ontstaat o.a. door rotting uit fibrine H-5 %o skatolhoudend indol, uit vleesch 1.7 — 5.8 %n. uit z.g. «vleeschfibrine» 2,8 — 3.4 %o. liet skatolgehalte van het hij rotting ontstane skatolhoudend indol is zeer wisselend. Dit varieert van 0% —bijna lüd u/0 van het mengsel, zonder dat de oorzaken van deze schommelingen konden worden opgespoord, (bacteriën?). Indol en skatol komen derhalve constant voor onder de ontledingsprodukten, en wel in dier voege, 1 Z. f. Physiol. Ch. III pag. 134: Ueberdie aromatischen Produkte der Faulniss aus Eiweiss. / ' Physiol. Gh. II pag. 420: Z. Kenntniss der Pankreasverdauung. Z. I. Physiol. Cli. VIII pag. 417: Z. Kenntniss der Eiweissfaulniss I. 1- Physiol. Ch. IX pag. 8: Z. Kenntniss der Eiweissfaulniss II. Her. «1. (I. Ch. Ges. XII! pag. 189: Weitere Beitrage z. Kenntniss der baulnissprodukte aus Eiweiss. d;it liot indol geheel of gedeeltelijk voor liet skatol in do plaats kan treden. Beide onderzoekers meenen dan ook in liet eiwitmolecnul een atoomcoinplex te moeten aannemen, waaruit beide stoiTen ontstaan. Indol ontbreekt nooit geheel, skatol eene enkele maal. In de verschillende eiwitsoorten schijnt de indolgroep van ongelijke grootte te zijn. In enkele punten wijken hunne resultaten van die van andere onderzoekers af: Zij vinden meer indol dan andere onderzoekers (Drieger, Odermatt.), hetgeen zij daaraan toeschrijven, dat deze het eiwit in open schalen lieten rotten, waardoor het indol kon verdampen, en dat zij geene rekening hielden met het niet in oplossing gegane eiwit. Met den duur der rotting neemt de hoeveelheid indol toe. Andere onderzoekers hadden dit niet gevonden, wat eveneens op rekening der verdamping kan worden gesteld. liet indol schijnt niet onmiddellijk uit het eiwit te worden gevormd, maar eerst schijnt eene tusschenstof te ontstaan, want de hoeveelheid indol neemt bij de rotting in sterkere progressie toe dan de hoeveelheid eiwit, die in oplossing is gegaan. Met indol wordt hierbij natuurlijk bedoeld: skatolhoudend indol. liet skatolderivaat, dat na distillatie in het residu achterbleef, bleek te zijn: skatolcarbonzuur C11( H9 N02. Dit is een éénbasisch zuur, dat in kleine plaatjes kristalliseert, die gemakkelijk in alkohol en aether en moeilijk in water oplossen. Smeltpunt: 104°C. Boven liet smeltpunt verhit, ontleedt het zich in skatol en CO.,. Het kan gemakkelijk worden aangetoond door de volgende gevoelige reacties: De waterige oplossing geelt niet een paar droppels UNO, en een paar droppels - "Ai KNOj-opl. eene roode kleurstof, 0 gr. skatol. De urine gaf door toevoeging van sterk HC1, vooral bij verwarming, eene sterke skatolroodreactie. /ij reduceerde alkalische koperoplossing en in den polarimeter gaf zij eene linksdraaiing van 1.5" bij ccnc buislcngte van '20 c.M. Dc hoeveelheid gepaard zwavelzuur was sterk vermeerderd. Toch kon hij geen skatoxylzwavelzuur uit deze urine verkrijgen. Bij eene tweede proef was de hoeveelheid gepaard zwavelzuur niet vermeerderd, hoewel de urine veel skatol rood leverde. Met nog andere proefhonden vielen C.CH(NH1).COOH + 112 - Nll, + CJ14< >C.CH2.COOH /CH, CH, . c c ( c«h4c.coon = co2 + c0h4ch „ /CH, ✓ c 7 ch c6h4ch + o, = ii20 h- co2 + c6h4ch Het hangt van de omstandigheden af, welk eindprodukt wordt gevormd. Tot die omstandigheden behooren temperatuur, toetreding of afsluiting van zuurstof, soort der bacteriën. Laat men n. 1. eiwit rotten door bet sereuse vocht uit de gezwellen van dieren, die aan «Rauschbrand» lijden, waarin ook de Miciococcus acidi paralactici voorkomt, dan vindt men onder de ontledingsproducten groote hoeveelheden skatol, wat, hij rotting door den «ltauschbrand» bacil alleen, nooit voorkomt. Bij eene dergelijke rotting van lijm ontstaat nooit tyrosine, indol of skatol (Selitrenny) '). Zeer interessant zijn ook de onderzoekingen van Cole en Hopkins i), die eene schoone bevestiging leveren van Nencki's hypothese omtrent de moederstof van liet skatol etc. in het eiwitmolecuul. Uit de produkten, verkregen bij pancreasdigestie van eiwit (speciaal caseïne), konden zij eene stof afzonderen, die de reactie van Adainkiewiez (glyoxylzuur) gaf. Deze stof lost moeilijk in koud, makkelijk in warm water op tot eene zuur reageerende vloeistof. Zij kristalliseert in lijne witte glinsterende plaatjes, die geen scherp smeltpunt hebben. Het smelten begint bij 220° 0. en eindigt bij 252° C. Bij verdere verhitting wordt zij ontleed onder C üj-ontwikkeling en ontstaat de reuk van indol en skatol. Deze is het totnogtoe niet afgescheiden tryptophaan van Neumeister •1). De analyse leidde tot de formule Cu H(ï N2 02, overeenstemmende met de empirische formule van Nencki's skatolamidoazijnzuur. Een tryptophaanoplossing niet gelatine en voedings- ') Ber. d. k. Akad. d. Wiss., Math.-Nat. Wiss. Cl. XCVIII Abtli. 11b pa?. 870: Ueber die Zersetzun? des Leimes durcli anaërobe Spaltpilze. 1 Journ. of Physiol. XXVII pag. 418: Ühemistry of proteids 1. Jonrn of Physiol. XXIX pa?. 451: Chemistry of proteids II. •') Z. f. Biologie N. F. Vr 111 pag. 329, Noot: Ueber die Heactionen der Albumosen u. Peptonen. zouten, geënt met aërobe bacteriën, leverde skatol, indol en skatolcarbonzuur; eene dergelijke oplossing, geënt met anaërobe bacteriën, daarentegen skatolazijnzuur. Door smelten van tryptoplnian met KOH ontstaat skatol, NH, en oxaalzuur. Zij concludeeren derhalve dat tryptophaan skatolamidoazijnzuur is en geven daaraan, overeenkomstig Nencki's formule van skatolazijnzuur, de volgende structuurformule: /CH3 ✓ C V 0,1 H«CH/C-CH(NH«)C00H- Deze structuurformule schijnt evenwel niet juist te zijn. VVislicenus en Arnold ') hadden reeds aangetoond, dat aan het door rotting uit eiwit verkregen skatolcarbonzuur eene met bovenstaande formule homologe formule niet toekomt. Door hen was uit phenylhydrazinpropionylmierenzuur skatolcarbonzuur met deze structuur bereid: .CHj CHj.CH.; c 7 n^C - COOH = C0H4< /C.COOH + NH, jN2II INll dat niet identisch was met «rottings«skatolcarbonzuur. Eenigen tijd daarna kon Ellinger 2) uit phenylhydrazin-p-aldehydopropionzuur eene stof bereiden, die daarmede wel identisch was: .ClIj.COOII CHj.CHJ.COOH c CoH.x „>CH = NH, + C„ H4< /CH N2H NH !) Liebig's Ann. CCXLV1 pag. 334: Ueber die Synthese von Keton s&u re-e stern. 2) Her. (1. (1. ch. (Jes. XXXVII pag. 1801: lleber Hie Consiiiution der Inriolgruppe aus Eiweiss. Het z. g. skatolearbonzuur uit eiwit blijkt dus te zijn indolazijnzuur. Dienoverkomstig moet dus ook de structuurformule van skatolazijnzuur en skatolamidoazijnzuur verandoren. Voor deze laatste verbinding bestaan derhalve, in verband met de plaats der N H.,groep, vier mogelijkheden. Nu wordt tryptophaan bij honden als kynurenzuur uitgescheiden en dus kiest hij als structuurformule van tryptophaan (resp. skatolamidoazijnzuur): (NH,)CHj )CH.COOH. C-"'WCH Natuurlijk brengt de betere kennis dezer structuurformules geene verandering in de conclusies van Salkowski, Nencki. Cole en Ilopkins omtrent de aromatische groepen van het eiwitmolecuul. Het is dus wel begrijpelijk, dat men: lo. wegens het voorkomen van een atoomcomplex in het eiwitmolecuul, waaruit bij rotting indol en skatol ontstaat (Cole en Hopkins, Salkowski, Nencki): 2o. wegens den overgang van indol in indoxylzwavelzuur resp. glycuronzuur; 3o. wegens het voorkomen van eene kleurstof in urine, die in eigenschappen en bereidingswijze overeenkomst vertoont met kleurstoffen, die uit skatolderivaten (skatolearbonzuur) zijn te bereiden (Salkowski, Nencki); 4o. wegens eene aangenomen (niet bewezen!) vermeerdering van die kleurstof in de urine van dieren, welken men skatol bij hunne voeding had gegeven (Brieger, Mester, Grosser); 5o. wegens eene (wel is waar niet constante) toe- noming van de hoeveelheid gepaard zwavelzuur in de urine van dergelijke dieren (Brieger, Mester, Grosser) en het aantoonen van skatoxylzwavelzuur (?) in de urine van een diabeteslijder (Otto); aanneemt, dat skatoxylzwavelzuur de moederstof is van het z. g. skatolrood. Eveneens is het begrijpelijk, dat Mester bovendien nog skatoxylglycuronzuur als de moederstof beschouwt, al steunt zijne conclusie op zwakke gronden. Stokvis '), die eene methode aangaf om de moederstof van het z. g. skatotrood uit urine af te scheiden, kon echter geen gepaard zwavelzuur of glycuronzuur aantoonen en hield het chromogeen voor skatolazijnzuur of skatolearbonzuur. Dat het chromogeen in staat zou zijn methaemoglobine te leveren, wanneer het met haemoglobine in aanraking komt, gelijk Stokvis meende, is door Steensma 2) bewezen onjuist te zijn. Hoe algemeen dan ook het skatoxylzwavelzuur als liet chromogeen van hetz.g. skatolrood wordt beschouwd, toch is deze hypothese niet zonder bestrijders gebleven. Reeds in 181)1 wees Rosin 3) er op, dat al hetgeen omtrent het voorkomen van skatolrood in urine was medegedeeld, onbewezen hypothese was. Bij zijn onderzoek had hij nooit eene dergelijke kleurstof aangetroffen en alle roode kleurstoffen, «1 ie hij had gevonden, ') Tijdschr. v. Gen. 1901. I pag. 9til en Hand. Ned. Nat.-en Geneesk. Congr. 1901. pag. 249: Over de scheiding der moederstof van het indigoblauw van die van het skatolrood in de urine van den mensch. Tijdschr. v. Geneesk. 1902. II pag. 678 : Bjjdrage tot de casuistiek der autotoxische enterogene cyanosen. l) Tijdschr. v. Geneesk. 1904. II pag. 425: Over het voorkomen van nitrieten in urine en hunne beteekenis voor het qual. en quant, urineonderzoek. *) Virchow's Arcli. CXXI11 pag. 519: Ueber das Indigoroth. waren öf indigorood öf eene der andere «bekende» roode urinekleurstoffen. (vooral urorose'ine). Hij vindt het dan ook overbodig om als de oorzaak der roodkleuring in urine skatolderivaten te beschouwen. Het moet echter een raadsel blijven, hoe hij eene in chloroform onoplosbare kleurstof (zooals het z.g. skatolrood is) indigorood kan noemen ! Eveneens een heftig bestrijder vinden wij in Maillard'). Hij begint met alle als zoodanig beschreven kleurstoffen als indigorood te beschouwen, derhalve eveneens voorbijziende. dat de z.g. skatolkleurstof »ict in chloroform oplosbaar is. Zijn andere argumenten hebben meer waarde: Aan het skatoxylzwavelzuur ontzegt liii alle recht van bestaan, omdat niemand het ooit heeft gezien en omdat het begrip skatoxyl onvereenigbaar is met de chemie van de indolgroep. Immers is in het skatol reeds de methylgroep getreden op de plaats, waarop een hydroxyl zou moeten worden gevonden om skatoxyl te verkrijgen, dat aan indoxyl analoog was: /CH, C(OH) C ( C„H,< NH >CI! C.H.CH (Indoxyl). (Skatol). Het invoeren van O op de verlangde plaats zou dus geven of: /OCH, C,Hi .1IT/CH d. i. indoxyhnethvlaether, NH of: C(OH) CuH4\ /CH d. i. indoxyl: ') l.'indoxyle urinairc. Paris. Schleichcr Frères & Cio. 1903. Hij hoeft dan ook de vaste overtuiging, dat het skatol in liet organisme zijn methylgroep verliest en als moederstof van liet indigorood in de urine verschijnt. Zijne argumenten zouden echter een ander skatolderivaat als chromogeen niet uitsluiten! Porcher en Hervieux ') hebben zich eerst bij deze meening aangesloten. In eene latere publicatie ^evenwel komen zij daarop terug. Zij experimenteerden met dieren, wier urine door melkdiëet indicanvrij was geworden. Na subcutane injectie van skatol kon uit de urine door HC1 eene roode kleurstof worden bereid, die niet door chloroform kon worden uitgeschud. Terecht wijzen zij hier nadrukkelijk op dit verschil met indigorood. Zij achten niet onmogelijk, dat het chromogeen een zout is. waaruit door HC1 een roodgekleurd zuur wordt vrijgemaakt. Het chrumogeen wordt niet gepraecipiteerd door loodacetaat, onvolkomen door basisch loodacetaat, volkomen door kwiknitraat. Omtrent den aard van het chromogeen laten zij zich niet uit. Zij achten de identiteit met uroroseïne van Nencki en Sieber, met purpurine van Golding Bird, met urohaematine van Harley, met de kleurstof van (liacosa en met de skatol kleurstof van Jtrieger, Mester on Otto zoer waarschijnlijk. ') /. f. Physiol. Gh., XXXÏX pajr. 154: Ueber Harnindican. Compt. rond. de 1'acad. des sciencos de Paris, CXXXVill 1725 : Couleurs urinairos après rinjoction du scatol. II. Zekerheid omtrent den aard van liet skatolroodcl H omogeen is dus nog niet verkregen. Slechts éénmaal is uit urine van een diabeteslijder eene verbinding verkregen, waarvan bet stikstof- en zwavelzuurgehalte met dat van skatoxylzwavelzuur overeenstemde. (Otto). De meening van Maillard en Rosin. dat de z. g. skatol kleurstof' wel indigorood zal zijn, wordt niet door bewijzen gesteund. Ook spreekt een belangrijk feit tegen deze meening: Wanneer men urine met HOI en een oxydeerend middel (b. v. een paar droppels zeer verdunde KN0.2oplossing) kookt, kleurt zich de urine rood. Door uit te schudden met choroform kan men een gedeelte der roode kleurstof in de chloroform doen overgaan. Daarna is met amylalkohol steeds nog eene tweede roode kleurstof uit te schudden, die zich èn spektroskopisch èn door zijn onoplosbaarheid in chloroform van liet indigorood onderscheidt. Men kan zich bij iedere urine hiervan overtuigen, vooral wanneer men deze eerst behandelt met (NH4),SO.i. (Zie pag. 19). Evenmin is echter de meening der andere onderzoekers bewezen, dat de kleurstof een skatolderivaat is. De resultaten van Brieger en Mester missen alle bewijskracht, aangezien geen van beiden skatoxylzwavelzuur hebben kunnen verkrijgen. En ook zou linnne conclusie, dat het chromogeen een gepaard zwavelzuur is, zelfs wanneer zij bewezen ware, niet zonder nader bewijs op normale urine mogen worden toepasselijk verklaard. Rij de toediening van dergelijke betrekkelijk groote hoeveelheden skatol zon het niet te verwonderen zijn, wanneer het organisme op huitengewone wijze deze stol' trachtte uit te scheiden. Feitelijk is dus thans de stand van zaken aldus: In normale urine is aanwezig een chromogeen. waaruit eene goed gedefiniëerde roode kleurstof is te bereiden, zonder dat omtrent den aard van dit chromogeen met zekerheid iets bekend is. Hieromtrent iets naders te weten te komen, was mijn doel en daartoe was dus noodzakelijk dit chromogeen uit de urine af te scheiden. Daartoe heb ik gebruik gemaakt van de reeds genoemde, door Stokvis aangegeven, methode tot scheiding van de moederstof van het indigoblauw van die van het skatolrood in de urine van den mensch. Dienovereenkomstig wordt de (normale) urine verzadigd met ammoniumsulfaat en laat men haar staan tot alle praecipiteerbare stoffen (urobiline, uroërythrine, c.<]. galkleurstolfen en haematoporphyrine, welke beide laatste stollen in de gebruikte urine natuurlijk niet voorkwamen), zijn neergeslagen. Xa filtratie wordt het liltraat op een waterbad ingedampt en na afkoeling afgeschonken van het uitgescheiden ammoniumsulfaat, daarna met enkele droppels azijnzuur zuur gemaakt, met azijnaether (2 a 3 maal) uitgeschud en in een scheidtrechter van den azijnaether gescheiden. De lichtgeelgekleurde azijnaether bevat dan de moederstoll'en van het indigoblauw en van het skatolrood. Door 2 a 3 maal met water uit te schudden, is de azijnaether geheel te bevrijden van het indoxylzwavelzuur. De tweede moederstof (n.1. die van liet skatolrood) kan men aan den azijnaether onttrekken door uitschudden met kaliloog. Deze mi iet zoo sterk zijn, dat de zure reactie van den azijnaether geheel verdwijnt. De kaliloog neemt eene intensief gele kleur aan. terwijl de azijnaether geheel ontkleurd wordt. Alvorens den azijnaether met kaliloog uit te schudden, heb ik mij door middel van Rouma's reagens') (20 mgr. isatine op 1 L sterk HC1.) steeds overtuigd, dat in het laatste water, waarmee de azijnaether uitgewasschen was, geen indoxylzwavelzuur meer overgegaan was en dus de azijnaether geheel daarvan bevrijd was. De alkalische vloeistof geeft met Rnnma's reagens zoo goed als geene verkleuring. Met Obermayer's reagens (2 gram FejCl,jOp 1 L. zoutzuur van S. G. 1.49) ontstaat geene groene of blauwe kleur, zooals met indican het geval zou zijn. maar eene schoone purperroode kleurstof. Ook door andere oxydeerende middelen is deze kleurstof te bereiden: zoutzuur metchoorkalk, zwavelzuur met ammoniumpersulfaat. Ik gebruikte steeds zoutzuur en eene zeer verdunde oplossing van kaliumnitriet (0,2 a 0.."> %), die mij in het gebruik veel gemakkelijker te doseeren bleek. Men moet n.1. zeer oppassen, om niet te sterk te oxydeeren. aangezien dan de roode kleur slechts voorbijgaande of in het geheel niet ontstaat, doch de oplossing lichtgeel wordt. Dij behandeling van deze vloeistof alleen met HCI (dus zonder toevoeging van een oxydeerend middel) ontstaat geen roode kleurstof. De roode kleurstof vertoont twee absorptiestrepen in het groen tusschen D en E. Zij laat zich aan de waterige oplossing geheel ') Onderzoekingen Physiol. Lab. te IHreetil, 19(11, 5de reeks II pag. 332 en Z. f. Physiol. Ch. XXXII pag. 82. door amylalkohol en gedeeltelijk door azijnaether onttrekken. Aether en cloroform doen dit niet. l!ij neutralisatie der zure oplossing wordt de kleur geelbruin, terwijl toevoeging van zuur dan de roode kleur weer doet verschijnen. Steensma ') behandelt de urine met basisch loodacetaat iu plaats van (NH4)2S04. Na de publicatie van zijn onderzoek lieb ik van 1000 c. c. urine de eene helft volgens Stokvis met (NIIJ.SO, de andere helft volgens Steensma met basisch loodacetaat behandeld en daarna beide porties verder bewerkt ter verkrijging van de moederslof. daarbij zorg dragende, dat zij daarna precies dezelfde bewerking ondergingen, wat betreft de hoeveelheid azijnaether, waarmee zij werden uitgeschud. etc. Het bleek mij, dat bij de behandeling volgens Stokvis meer chromogeen te verkrijgen was, terwijl bij de behandeling volgens Steensma de urine nooit geheel van chromogeen was te bevrijden. De reden is mij eerst later duidelijk geworden. (Zie hoofdst. VI). De alkalische vloeistof, volgens de methode van Stokvis verkregen, heb ik met azijnzuur geneutraliseerd, voor ik ze aan verdere bewerking onderwierp. Het chromogeen uit deze vloeistof af te scheiden is mij niet gelukt. Op verschillende wijzen heb ik dit getracht te doen, en wel of door indamping en uitkristallisatie, óf door praecipitatie met metaalzouten. Bij indamping, gedeeltelijk op het waterbad en verder iu een exsiccator boven I12S04. ontstaat eene bruine stroperige massa, die bij mikroskopisch onderzoek ') Tgdsclir. v. Geneesk. 1904 II pa;;. 425: Over liet voorkomen van nitrieten in urine en hunne beteekenis voor het quant, en qualit. urine onderzoek. talrijke kristallen van kaliumacetaat blijkt te bevatten. Met bleek mij onmogelijk dit kaliumacetaat te verwijderen wegens zijne groote oplosbaarheid en ook omdat het chromogeen in dezelfde vloeistoffen oplosbaar resp. onoplosbaar als kaliumacetaat is. lïij pogingen om door praecipitatie met metaalzouten het chromogeen af te scheiden, bleek, dat een chromogeenlioudend praecipitaat ontstond door Pb, Hg en Ag. Loodacetaat (basisch en neutraal) praecipiteerde de gezochte stof slechts onvolkomen; zoowel het praecipitaat als het afgefiltreerde en nu veel minder sterk gekleurde (iltraat gaven met IIC1 en KN02 de karakteristieke kleur. Door AgNO-, werd het chromogeen volkomen neergeslagen. Dit lichtgele praecipitaat werd in het licht in een paar minuten zwart; in het donker bewaard geschiedde hetzelfde in c" een half uur. Eveneens ontstond een volkomen praecipitatie van het chromogeen door mercuriacetaat (resp. nitraat). Dit was eene geelbruine amorphe stof. die in de gebruikelijke oplossingsmiddelen niet oploste, wel in sterke zuren (HC1.) Bij ontleding van het in water gesuspendeerde kwikpraecipitaat door 1I2S. ontstond eene zure vloeistof, die, hij gebruik van mercuriacetaat, sterk naar azijnzuur rook. zoodat men hij slot van rekening even ver was als met de oorspronkelijke vloeistof. I!ij gebruik van mercurinitraat zag men na ontleding door H,S roodkleuring ontstaan; men mag dus wel aannemen, dat in dit geval de eveneens zure vloeistof, behalve het vrijgemaakte UNO,, ook een spoor HN02 bevatte, wat na het gebruik van mercurinitraat niet zoo erg behoeft te verwonderen. Het door mercurini- traat neergeslagen chromogeen leverde dan ook reeds bij koken met HC1 alleen de roode kleurstof. Door deze eigenschappen was het kwikpraecipitaat niet te gebruiken. Vervolgens heb ik getracht het chromogeen direct uit den van indican bevrijden azijnaether te verkrijgen door middel van verschillende metaalverbindingen, n. 1.: MgCOa, Dl CO,. SrC03, CaCO,, ZnCO, en Cu(OII).2. De beste resultaten werden verkregen met MgC03. De andere metaalverbindingen leverden óf moeilijkheden bij de bereiding op, (zoo verkreeg men met CaC'Oj en BaC03 steenharde praeparaten, die slechts met de grootste moeite tot oplossing te brengen waren), óf zij gaven een praeparaat, dat voor het bloote nog reeds telkens verschillen opleverde, zooals b. v. de praeparaten, verkregen met Cu(OII),, die telkens eene verschillende kleur vertoonden. De bereiding van het magnesiumpraeparaat geschiedt als volgt: De van indican bevrijde azijnaether wordt in eene glazen kolf gemengd met MgCOs, die men gedurende 24 uur laat staan, terwijl men het mengsel van tijd tot tijd omschudt. Daarna wordt de inhoud van de kolf in eene uitdampschaal uitgegoten en laat men den azijnaether geheel aan de lucht verdampen Men houdt dan eene bruin gekleurde massa over, die gemakkelijk tot poeder is te brengen. Dit poeder wordt met alkohol van 98 % uitgetrokken, en daarna het extract van de rest afgeliltreerd. Zooals men zich gemakkelijk kan overtuigen, is het chromogeen dan geheel in den alkohol overgegaan. De bruingekleurde, neutraal reageerende, oplossing wordt tot droog ingedampt, het residu nogmaals in alkohol van 98 % opgelost, de oplossing ten overvloede nog eens gefiltreerd en daarna weer tot droog ingedampt (in den exsiccator). Dit Mg-praeparaat is een geelbruin amorph poeder, dat oplosbaar is in water, alkohol, minerale zuren en alkaliën. onoplosbaar in aetlier, chloroform en aceton. Hij verbranding laat het eene witte asch na. Bij sublimeeren, dat evenals verbranden met een zeer onaangenamen reuk gepaard gaat, ontwikkelen zich witte dampen en blijft koolstof achter. Het praeparaat heeft een niet onaangenamen aromatischen geur. Bij spektroskopisch onderzoek in neutrale, zure en alkalische oplossing worden geen absorptiestrepen waargenomen. Toevoeging van HC1 en een droppel 0,5 % KNO,oplossing aan eene oplossing van het praeparaat doet eene roode kleur ontstaan, die vooral bij verwarming goed voor den dag komt. Door HC1 alleen blijft de oplossing van het praeparaat onveranderd. Hier is dus zeker geen sprake van het vrij maken van een roodgekleurd zuur, maar is eene oxydatienoodig tot de vorming van de kleurstof. Aan de waterige oplossing laat de kleurstof zich gedeeltelijk door azijnaether, geheel dooi' amylalkohol onttrekken; evenwel in het geheel niet door aether of chloroform. Dooi' neutralisatie verandert de roode kleur in eene geelbruine, die door toevoeging van zuur weer rood wordt. Door Zn wordt de zure oplossing van de kleurstof ontkleurd; laten staan aan de lucht of oxydatie roept de roode kleur weer te voorschijn. IJij verhitting van de kleurstof met Zn heb ik nooit skatol- of indolreuk waargenomen. Bij spektroskopisch onderzoek der roode kleurstof in zure oplossing vindt men twee absorptiestrepen: eene in het begin en eene zwakke aan het eind van het groen. Verder blijkt, dut het violette gedeelte van het spektrum verduisterd is. Bij bereiding van de kleurstof uit meer geconcentreerde oplossing van het magnesiumpraeparaat, waartoe natuurlijk meer KN02 wordt vereischt, scheidt zicb bij afkoeling een gedeelte der kleurstof uit. Dit praecipitaat, afgefiltreerd en uitgewasschen, is in verse) ïen toestand oplosbaar in alkohol en aceton. Laat men bet staan, dan neemt het eene bruinzwarte kleur aan en is niet meer door alkohol en aceton tot oplossing te brengen. Alleen sterke minerale zuren lossen het bij koken met een bruine kleur op. Deze oplossing vertoont geen ahsorptiestrepen, in tegenstelling met de alkoholische oplossing van het versche praecipitaat, die dezelfde spektroskopische eigenschappen heeft als de oorspronkelijke oplossing, waaruit de kleurstof zich heeft afgescheiden. Het chromogeen in dit magnesiumpraeparaat levert dus eene kleurstof met dezelfde eigenschappen, als die bereid uit de alkalische oplossing, verkregen door uitschudden van den indicanvrijen azijnaether met KOH, (d. i.: het zoogenaamde skatolrood). III. Het eerst moest nu worden uitgemaakt, of' dit Mgpraeparaat eene constante samenstelling had of niet, waartoe dus het gehalte aan Mg, C. H, en N moest worden bepaald. Bovendien is door mij een quantitatief onderzoek op S verricht en een qualitatief op P (negatief). Tot dat doel heb ik vijf verschillende praeparaten van c» 1 gram bereid voor de bepaling van C. H. en N. Voor 1 gram praeparaat is 30 a 35 L. urine noodig. Deze praeparaten zal ik aanduiden met de letters A. B. C 1) en h. Bovendien heb ik nog een praeparaat t bereid voor vergelijkende X-bepalingen volgens Dumas en Kjeldahl. Voor de S-bepaling heb ik vier verschillende praeparaten gebruikt en wel twee vooi' het quantitatief onderzoek op gepaard H2SO, en twee voor liet quantitatief onderzoek op het totale S-gehalte. Zoowel voor deze als volgende bepalingen is de aangegeven gewiehtshoeveelheid steeds die van eene bij 1U5 a 11(1° C. tot constant gewicht gedroogde hoeheelheid. 1. Mg-bepaling. De stof werd in een platinakroes verbrand, de asch in I1C1 opgelost en overgebracht in een bekerglas, waai bij ik zorgde, dat de platinakroes goed werd nagespoeld met water en dat dit spoelwater eveneens in het bekerglas werd overgebracht. Door NH3,(NH4)C1 en Na,IIPOj werd bet magnesium als Mg(NH4)P04 neergeslagen. Dit praecipitaat werd na 2't uur afgefiltreerd 0}) een aschvrij filter, daarna goed uitgewasschen met verdunde NH3-oplossing (1 dl. 10% NH, op 3 dln. H20) en na droging met het filter in een gewogen platinakroes verbrand en gegloeid tot constant gewicht. Het Magnesium werd dus op de gewone wijze als Mg,P,07 bepaald. Van praeparaat A. gaf: 0,2472 gr.: 0,1210 gr. Mg2P207 = 0,02636 gr. Mg = 10,66 %; van praeparaat B: 0.3286 gr.: 0.1488 gr. Mg2P207 = 0.032173 gr. Mg = 9.79%. (Evenwel mag deze bepaling niet in rekening worden gebracht, aangezien tijdens de weging van het gevormde Mg,P207 iets uit de kroes is gespat); van praeparaat C: 0,1905 gr.: 0.0882 gr. Mg2P207 = 0.01907 gr. Mg = 10.01 %; van praeparaat D: 0,1947 gr.: 0.0911 gr. Mg2P207 = 0,0197gr. Mg = 10,12 %; van praeparaat E: 0,2447 gr.: 0.1160 gr. Mg.l',07 = 0,0251 gr. Mg = 10.25 %. 2. Bepaling van C en H. De stof' werd in eene gesloten verbrandingsbuis verbrand met loodchromaat en ten slotte in een zuurstofstroom. Het gevormde water werd opgevangen in een gewogen buisje met CaCl2, het gevormde koolzuur in 1 twee gewogen huisjes, voor de eene helft gevuld met natronkalk en voor de andere helft met CaCI,. Van praeparaat A gaf: 0,32«X3 gr.: 0,5013 gr. CO, = 0,15308 gr. C = 40,03 °/0 en 0.1504 gr. H,0 - 0.01071 gr. H = 5,00 "/„ ■ van praeparaat U: 0."21-2-2 gr.: 0,4051 gr. CU, = 0,12085 gr. C = 40,00 % en 0,1233 gr. 11,0 = 0,0137 gr. ü = 5,03 %; van praeparaat C: 0.2002 gr.: 0,4542 gr. CO, — 0.1238 gr. C = 46,53% en 0.1154 ü-r. HO = 0,01282 II = 4 «2°/, • u - " O I tl ? van praeparaat 1): 0,2148 gr.: 0.30»>1 gr. CO, ~ 0,09085 gr. C = 40.48 % en 0,0951 gr. H,0 = 0,01050 gr. H = 4.92 % ; van praeparaat E: 0,2184 gr.: 0,3740 gr. CO, = 0,1020 gr. C = 40,70% en 0.0995 gr. 11,0 = 0,01105 gr. II — 5,00%. 3. N-bepaling. Van praeparaat A werd liet N-gelialte volgens Kjeldalil bepaald. Aangezien evenwel zelfs na 2% a 3 uurdestiiieeren geen kleurloos product werd verkregen, heb ik, alvorens verder te gaan, van praeparaat F een paar vergelijkende bepalingen volgens Üunias en volgens Kjeldalil verricht, liet resultaat was, zooals uit onderstaande analyses blijkt, van dien aard, dat de overige bepalingen uitsluitend volgens Dumas zijn verricht en alleen de volgens deze methode verkregen resultaten in rekening zijn gebracht. Tor bepaling volgens Kjeldahl word de stof in een Kjeldahl-kolfje gedestrueerd met PjOr,-houdend H2S04 (100 gr. PjOr, op 1 L. sterk HaSO,) en een druppel kwik. Het daarbij verkregen product werd opgelost in water, overgebracht in een distilleerkolf en na toevoeging van sterke KOH en van K2S tot op de helft atgedistilleerd- De ontwijkende ammoniak werd opgevangen in eene afgemeten hoeveelheid '/, N—HjS04 en het niet geneutraliseerde H2S04 door titreeren bepaald. (Indicator: methyloranje.) Ter bepaling volgens Dumas werd de stof in eene COj-atmospheer verbrand met CuO en de ontwikkelde stikstof opgevangen in eene eudiometerbuis boven kwiken KOH. De eudiometerbuis werd overgebracht in gedistilleerd water en na afkoeling en gelijkstelling van het niveau binnen en buiten de buis de hoeveelheid N gemeten. Voor de berekening is het gewicht van 1 c.c. vochtige stikstof ontleend aan de tabel, voorkomende in: «Gattermann, die Praxis desorganischenChemikers». Van praeparaat F: a) (volgens Dumas) gaf: 0,3060 gr.: 10 c.c.N (t = 18,3ÜC., h = 764 mM. Hg.) = 11,595 mgr. N of 3,79 "/„; 0,2071 gr. : 6 c.c.N (t = 23,3°C., h = 756 mM. Hg.) = 6,7152 mgr. N of 3.20 %; 0.2233 gr.: 0.75 c.c.N (t = 21,4#C., h = 759 mM. Hg.) = 7.0747 mgr. N of 3,44 %; 0,3147 gr.: 9,5 c.c.N (t == 21,4#C., h = 765 mM. Hg.) = 10,865 mgr. N of 3,45 °/0; h) (volgens Kjeldahl) neutraliseerde de ontwikkelde NH, van: 0,3724 gr.: 9,35 c.c. '/, N-H,S04 = 32,725 mgr. N of 8.78 n/0; 0,2386 gr.: 4.15 c.c. % N-H,SO, = 14,525 mgr. N of 6,09 % ; 0,177:$ gr.: 1,05 c.c. . Totale hoeveelheid S. De stof werd gesmolten niet een mengsel van KN03 en Na2CO:;, het residu met water uitgetrokken en deze waterige oplossing tot droog verdampt. Het residu werd opgelost in 11C1 en weer tot droog verdampt, hetgeen 4 a 5 maal werd herhaald. Ten slotte werd het residu in water opgelost en bij zwakzure reactie onder verwarming BaCi., toegevoegd. Na 24 uur werd dit verder behandeld als sub. a): 0,1435 gr. gaf: 1,1 mgr. BaS04 of 0,2 mgr. S.; 0,1017 gr. gaf: 4.5 mgr. BaS()4 of 0,8 mgr. S. Deze resultaten geven het recht de stof alszwavelvrij te beschouwen, temeer daar het gloeien op gas is geschied en in dat geval steeds sporen van zwavel worden gevonden. rlot beter overzicht volgen hier de resultaten, hij «le analyse verkregen, in eene tabel vereenigd: Mg. C. H. X. Praeparaat. % 7. | % % A. 10.00 40.03 5,00 — B. — 40.00 5,03 ! 3,209 C. 10.01 4G.53 4,82 3.31 D. 10,12 46,48 4,92 3 23 E. 10,25 40.70 5,00 3.010 F. | - - - 3,79 » — — — 3,20 » — _ _ 3,44 » — — — 3,45 Gemiddeld: 10,20 40,588 4.98 3,346 De cijfers hebben voldoende overeenstemming om het onderzochte praeparaat als constant van samenstelling te beschouwen. IV. Na deze, door de analyse, verkregen resultaten was liet noodig, de samenstelling van deze stof op te sporen en vooral na te gaan. of in dit praeparaat skatol aanwezig was of op weinig ingrijpende manier daaruit kon worden bereid. Ik heb eerst de stof aan droge distillatie in vacuo onderworpen. De stof werd met uitgegloeid zand vermengd en voorzichtig verwarmd in een graphietbad. Van 130°—210"C. gingen kleurlooze droppeltjes over. Deze reageerden sterk zuur en hadden don scherp prikkelenden geur van azijnzuur. Bij het hooger worden der temperatuur begonnen witte dampen over te gaan, die zich in den ontvanger condenseerden. Ten slotte bleef in het distilleerkolfje wat kool over. Het verkregen distillaat was oplosbaar in alkohol en rook naar benzaldehyd. Voegde men bij de alkoholische oplossing van liet distillaat eene alkoholische oplossing van symin. trinitrobenzol, dan gelukte het niet hierdoor een rood kristallijn praecipitaat te verkrijgen. Zooals v. Romburgh ') heeft aangetoond, geeft eene alkoholische oplossing van skatol met eene alkoholische oplossing van symm. trinitrobenzol na eenige oogenblikken een bijna quantitatief praecipitaat van symm. trinitrobenzol-skatol in roode naalden met smeltpunt 1831'. ') Hoe. (I. trav. chim. <1. Pays-Ras et. «lp la Rplüiïiie XIV paa('I,-oplossing aan de warme oplossing gaf geene troebelheid. Toch werd voor volkomen zekerheid dit mengsel warm gefiltreerd en daarna het filtraat, na toevoeging van zooveel iiCl, dat het gehalte 1 "/<• bedroeg, gedurende een uur verhit. Nog warm zijnde, werd de oplossing gefiltreerd, liet lilter in een platinakroes verbrand en na gloeiing van den kroes de evenfuëele inhoud met (sulfaatvrij) KXO., gesmolten in de blaasvlam. Na afkoeling werd de inhoud van den kroes met water uitgetrokken, de oplossing van de rest afgeliltreerd en aan het filtraat BaCI., en een weinig HOI toegevoegd. Er ontstond eene geringe (echter onweegbare) troebelheid. Ter controle werd een lilter, van dezelfde soort als boven, eveneens in een platinakroes verbrand, de rest met K,('0, gesmolten enz. en nu bleek in dit geval eveneens na de toevoegingvan het BaClj eene lichte onweegbare troebelheid te ontstaan. I it dit onderzoek en het onderzoek op gepaard zwavelzuur van liet Mg-praeparaat blijkt dus. dat liet onderzochte chromogeen niet als gepaard zwavelzuur voorkomt. Een onderzoek naar de mogelijkheid, dat het een gepaard glycuronziiur zou zijn, gaf eveneens een negatiel' resultaat. Na 1 uur koken met 1 a!2%. HC1 bleek eene oplossing van het chromogeen Fehling's proefvocht niet te reduceercn. Vervolgens heb ik een onderzoek ingesteld, oPskatol iu de stol was aan te toonen. liet biuingekleurde filtraat, dat bij de voorafgaande bepaling op H.,S(>4 na de toevoeging van het chlooibaryum was verkregen, en dat met HCI en KNO, de kleurreactie nog goed gal' en dus het chromogeen nog bevatte, werd in twee helften verdeeld Aan de eene helft werd NaOH tot sterk alkalische reactie en zinkstof toegevoegd, aan de andere helft Il.SO, en zinkstof. Beide vloeistollen werden aan distillatie onderworpen. Na alloop der distillatie gaven beide vloeistollen de kleurreactie nog even schitterend. De kleurlooze distillaten werden met aether uitgeschud; de aether afgedistilleerd, het residu (minimaal!) in alkohol opgelost en met eene alkoholische oplossing van symm. trinitrobenzol behandeld: geen skatol was aanwezig (noch indol). De afgedistilleerde bruine vloeistollen werden eveneens met aether uitgeschud; de aether afgedistilleerd; het residu (eveneens minimaal), na oplossing in alkohol, ook met trinitiobenzol behandeld: geen skatol of indol. Ook 11a het uitschudden met aether gaf' de bruine vloeistof' nog de kleurreactie. Distillatie van de bruine stroop in alkalische of'zure oplossing, zonder gelijktijdige reductie, gaf eveneens negatief resultaat. Het was «lus niet mogelijk langs dezen weg skatol of indol uit het chromogeen te verkrijgen. Er bleef nog over na te gaan. of de stof onder invloed van bacteriën skatol of indol kon leveren. Om de vereischte bacteriën te krijgen werd eene gelatiiieeultuur van tuinaarde gemaakt onder toevoeging van % Kjlll'O, aan het tot op vol. ingedampte waterleidingwater, dat voor de cultuur werd gebruikt '). Na een paar dagen verblijf in de broedstoof bij 40° ('. werden met de gekweekte bacteriën drie cultures aangelegd: a) eene nieuwe gelatiiieeultuur tor controle. b) eene peptoncultuur, waarin dus de gelatine van de eerste cultuur door pepton was vervangen. Na a ;> dagen gaf deze cultuur de nitrosoindolreactie, hetgeen in de gelatinecultuur natuurlijk niet geschiedde. c) eene gelatinecultuur als sub a, waaraan het chromogeen was toegevoegd. Iteactieder cultures: zwak alkalisch. Na ü 8 dagen geeft cultuur c bij behandeling met MCI en KN< )2 geene kleurreactie meer. Zij geeft evenmin de reactie met glyoxylzuur (reactie van Adamkiewicz). Bij distillatie der cultuur bij alkalische reactie (NaOH) kon in het distillaat op de reeds genoemde wijze geen skatol of indol worden aangetoond. De afgedistilieerde cultuur wordt met aether uitgeschud (bij zure en bij alkalische reactie) en dit aetherisch extract eveneens op skatul onderzocht: negatief. Ten bewijze, dat onder invloed der bacteriën de stof wel veranderd was, zij hier vermeld, dat thans bij uitschudden >) Deze voedingsbodem werd aangeraden door Prof. Beyerinck te Delft. met aether, zoowel bij alkalische als bij zure reactie, bruine stol' in don aether overging, hetgeen voor de werking der bacteriën nooit geschiedde. Ook heb ik nog eene cultuur gemaakt uit het chroinogeen,.waaraan alleen water en K,HPO, was toegevoegd, hi dit geval bleet' de cultuur zelfs na ;$ a \ weken nog (i() kleurreactie geven en scheen het wel, dat de bacteriën afstierven. Wanneer men 1111 in aanmerking neemt, dat de bekende skatolderivaten (waarvan alléén het skatolcarbonzuur eene bestendige roode kleurstof' levert), zoo gemakkelijk skatol afgeven (skatolcarbonzuur en skatolazijnzuur doen dit reeds bij verhitting boven het smeltpunt) en tevens, dat het mij niet mogelijk was uit de onderzochte stol, hetzij door sublimatie, hetzij door reductie en distillatie, hetzij door werking van bacteriën een spoor van skatol resp. indol te verkrijgen, dan is de conclusie zeker niet gewaagd, dat dit chrnmogeen hoogstwaarschijnlijk geen skatolderivaat is. Opmerkelijk is echter de overeenkomst tusschen de uit deze stof' te verkrijgen kleurstof' en de uroroseïne van Nencki en Sieber '). Zooals bekend is. bereidden Nencki en Sieber de uroroseïne door aan de urine een mineraalzuur toe te voegen, waardoor binnen I a .! minuten de kleurstof ontstaat. Hoewel zij geen oxydeerend middel toevoegden, konden zij toch de medewerking van de in de urine aanwezige nitrieten niet buitensluiten, zoodat deze bereiding geen verschil oplevert niet die van het z. g. skatolrood. Als eigenschappen geven zij op: 1. De kleurstof lost met roode kleur op in water, ') Journ. f. pr. Chemie N. F. XXVI pag. HH:i: Ueber das Urorosein. aethyl- en amylalkoliol, moeilijk in azijnaether. Aether, chloroform, benzol, zwavelkoolstof onttrekken de kleurstof niet aan de waterige oplossing. 2. I )e alkoholische oplossing geeft eene absorptiestreep in het begin van het groen tusschen I) en K, verder eene verduistering van het violette gedeelte van het spektrum. Zij constateeren ook wel eene zwakke tweede streep aan het eind van het groen, doch schrijven die toe aan een spoor van urobiline. .5. Alkaliën veranderen de roode kleur in bruin; door zuren verschijnt de roode kleur terug. Zinkstof in zure oplossing ontkleurt de roode vloeistof; hij staan aan de lucht keert de roode kleur terug. I. De oplossing kleurt wol, waarop zij door natriumacetaat in overmaat zoodanig gehecht wordt, dat zij slechts door koken met ll2S()4-houdenden alkohol weer in oplossing komt. Ken dergelijk onderzoek, door mij ingesteld met de z. g. skatolkleurstof, gaf dezelfde resultaten. Het eenige punt van verschil is de bestendigheid van de in hoofdstuk IV beschreven wijze werd uit 1,0139 gr. van het Mg-praeparaat het azijnzuur vrijgemaakt en afgedistilleerd. liet distillaat vereischte ter neut ral isath; = 67.4 c.c. 0.95 N—NaOlI = 3Xi,lN mgr. azijnzuur of 37,89 °/„. Het residu werd gebruikt om het hippuurzuur in den vorm van benzoëzuiir te bepalen. Xa neutralisatie van het residu heb ik het hippuurzuur hieruit gepraecipiteerd door Fe2(SO,)3, zorg dragende, dat de reactie neutraal bleef. Het praecipitaat werd a('gefiltreerd en uitgewasselien en door H,S04 (met gelijk vol. water verdund) weer tot oplossing gebracht. Ter controle werd eene hoeveelheid hippuurzuur (0,4098 gr.) op dezelfde wijze behandeld. Deze beide oplossingen werden gedurende 15 uren gekookt in kolven met omgekeerde koelhuis, om liet hippuurzuur te splitsen in benzoëzuur en glycocol '). Na afloop werden de oplossingen uitgeschud met aetlier en van deze aetherische oplossingen de aetlier afgedistilleerd. Tot mijne verrassing verkreeg ik op deze wijze, zoowel uit het Mg-praeparaat als uit het hippuurzuur, slechts sporen van benzoëzuur. II. Om mij te vergewissen van de betrouwbaarheid voor quantitatief onderzoek van eene methode, door Beilstein aangegeven, ter bereiding van benzoëzuur uit hippuurzuur, heb ik, volgens diens voorschrift, hippuurzuur gedurende '/4 uur met rookend HC1 laten koken in een kolf met omgekeerde koelhuis. Na afkoeling scheidde zich het benzoëzuur in kristallen uit. Daarna werd het zoutzuur met de benzoëzuurkristallen met aetlier uitgeschud en in een korthalzig wijdmondsch kolfje van deze aetherische oplossing de aether afgedistilleerd, terwijl ten slotte gezorgd werd, dat het uitkristalliseerende benzoëzuur zich in eene dunne laag over de binnenoppervlakte van het kolf je afzette. Dit kolf je met benzoëzuur bleef aldus 2 dagen bij kamertemperatuur (2.