[ 139(T Bhiii nii handboekbinderij asco ommen Tel 05291 - 1122' UNIVERSITEIT VAN AMSTERDAM HYGIENISCH-BACTERIOLOGISCH LABORATORIUM _'v*' • Bacteriologische - Serologische METHODEN en RECEPTEN SAMENGESTELD TEN BEHOEVE VAN HET BACTERIOLOGISCH PRACTICUM DOOR Jonkvr. M. VAN RIEMSDIJK BACTERIOLOOG - SEROLOOG ASSISTENTE AAN HET LABORATORIUM 1916 UNIVERSITEIT VAN AMSTERDAM HYGIENISCH-BACTERIOLOGISCH LABORATORIUM Bacteriologische - Serologische METHODEN en RECEPTEN SAMENGESTELD TEN BEHOEVE VAN HET BACTERIOLOGISCH PRACTICUM DOOR JONKVR. M. VAN RIEMSDIJK BACTERIOLOOG - SEROLOOG ASSISTENTE AAN HET LABORATORIUM 1916 HEOERL. MAATSCHAPPIJ TER BEVORDERING DES GENEESKUNST Het Ent- Platina oogje. instrumenten. Platina naald. Overenten. Met het Platina oogje worden geënt: A. Schuine vaste voedingsbodems Schuine Agar-Agar. Strjjk- „ Gelatine. cultuui Aardappel. enz. enz. B. Vloeistoffen: „ . . , . schudt een weinig van de cultuur in de Bouillon - Peptonwater vloeistol uit; de glasstaaf mag daarbty niet Lakmoeswei - Melk - in de vloeistof komen, anders springt deze b\1 Rundergal - enz. enz. het latere flambeeren. C. Vaste voedingsbodems in Glasdoozen (Petri'sche schalen of platen). Endo-plaat. Haemoglobine Soda Agarplaat. Bloed Agarplaat. Serumplaat. Techniek der enting, zie pag. 6. enz. enz. Met de Platina Naald worden geënt: A. Rechte vaste voedingsbodem*. Rechte Agar-Agar. Steek- '• Gelatine. cultuui „ Neutraalrood Agar. enz. enz. Steek met ïaald mlellen in voelingsbodem tot bijna ian de glastaaf toe, en haal dan erug. Plaats de ..Gelatine" voedingsbodems nooit hooger dan bjj 24° C. „ overige . „ .. 37© enz. i i l i Strijk met >ogje over ichuine op perviakte leen, zonler de voetingsbodem laarbjjtebeichadigen. Techniek van het overenten. Het doel van liet overenten is, organismen eener cultuur rein over te planten op een daarvoor geschikten sterielen voedingsbodem, dus zonder bijmenging van organismen van buiten, (verontreiniging). Door inachtneming der volgende handgrepen, is een voldoende steriliteit gewaarborgd, om een reine overcnting te verzekeren. Het overenten in Reageerbuizen (met statief). 2. Draaiende beweging der buis. 1. Draaiende beweging der buis. •-i—i / 4. Platina gedeelte rood gloeien, glasstaaf enkele malen door de vlam halen, (flambeeren). 8. Draaiende beweging der buis. 9. De cultuur waarvan wordt overgeênt, wordt eerst als onder „8" afgesloten, nadat de laatste der reeks overentingen is geschied. Het overenten in Reageerbuizen (zonder statief). 10. Draaiende bewoging der buizen. (Zie nog pag. 3 onderaan). 11. Het vallen van den Wattenprop uit het Pincet: "Wanneer de gestiriliseerde wattenprop uit het pincet valt, wat bij eerstbeginnenden door een spierkramp nogal eens voorkomt, mag deze niet zonder meer, op de buis geplaatst worden. Houdt de wattenprop daartoe dadelijk met het pincet In de vlam; tracht nu vooral niet de vlam der brandende prop uit te blazen, (er komen dan vanuit den mond opnieuw bacteriën op), maar druk de prop In de reageerbuis, zoodat de vlam daardoor" meteen wordt gebluscht. Desnoods kan men een geheel nieuwe wattenprop van steriele buis nemen, en er zonder meer opplaatsen. Het Glaspotlood: Het schrijven met het z.g. „Glaspotlood'', is dan alleen goed mogelijk, wanneer het glas vetvrij is. Voor het vetvrij maken der reageerbuis, houde men deze even in de vlam en laat daarna afkoelen. Voorwerpen die moeielvjk in de vlam te houden zijn, kolven, glasschalen enz., ontvette men, door ze af te wrijven met wat benzine of xylol. Het overenten in Glasdoozen. (Petri'sche schalen). Naam v. h. organisme. Datum der enting. 7. In plaats van het oogje wordt ook wel gebruikt: A. De Drigalsky'sche Spatel: g-lazen Men druppelt de aangelengde faeces staaf, of het bloed door middel van pipet op rechthoekig (l>hus Djagnostiek ) P^aa^> en wrijft dit nu over den omgebogen. geheelen plaat uit, met den uitgegloeiden afgekoelden spatel. B. De steriele Wattenprop aan metalen of houten steel: (Diphtherie \ Strijk de Wattenprop, waaraan keelDiagnostiek I of neusslijm, streepsgewijze over de enz. / plaat heen. De techniek der enting blijft verder precies dezelfde. Het eenvoudige microscopische Uitstrijkpraeparaat. Q. 24 uur oude cultuur (liefst van agar-agar) ; enz. enz. b. Objectglazen. C. Platina oogje. d. Schoon water of Physiologische zoutsolutie (0.85% NaCl Utensiliën : in water). €. Glaspotlood. ƒ. Filtreerpapier. g. Kleurstof, (in flleschje met trechtertje, waarin filtertje van filtreerpapier. Techniek der methode: 1°. Maak objectglas stofvrij (afwrijven met lap) en vetvrij (enkele malen door de vlam halen), en leg het boven op kleurbakje. 2°. Leg door middel van uitgegloeid oogje, druppel schoon water of zoutsolutie, midden op de ontvette zijde van het afgekoelde objectglas. 3°. Breng door middel van uitgegloeid oogje een weinig van de cultuur in het druppeltje, en wrijf gelijkmatig in de rondte uit. Mocht er teveel bacteriën-materiaal aan het oogje zijn, dan late men er eerst een vlokje van in het druppeltje vloeien; gloei het overige in de vlam uit, laat oogje even afkoelen, en wryf daarna de druppel gelijkmatig in de rondte uit. 4°. Desinfecteer oogje door uitgloeien (rood gloeiend). 5°. Laat praeparaat aan de lucht goed drogen of boven de Bunsensche vlam. 6°. Fixeer nu het goed droge praeparaat, door het enkele malen snel, met de praeparaatzijde naar boven, door de vlam te halen, (coagulatie van de eiwitten). 7°. Omgeef het object door 2 dikke glaspotloodstrepen, om het afloopen der kleurstof tegen te gaan, en de praeparaat-zijde te onthouden. Plaats vooral ook naast of boven ieder praeparaat de naam van het organisme. 8°. Oiet de gefiltreerde kleurstof op het praeparaat en laat die inwerken. 9°. Oiet eerst de overtollige kleurstof in het kleurbakje af en spoel het praeparaat onder de waterstraal. 10°. Droog praeparaat tusschen filtreerpapier en vervolgens nog boven de vlam. Het microscopisch onderzoek van het gekleurde praeparaat. Maximale lichtsterkte. Het is noodzakeltlk bij het microscopiseeren in het algemeen, beide oogen geopend te houden, het niet microscopiseerende oog op oneindig in te stellen, dus niet te laten accomodeeren. Om zich hierin te oefenen, doe men het volgende: Neem een stuk wit papier en houdt dit, tor wijl er gemicroscopiseerd wordt, horizontaal tegen de tubus aan, dicht bij het niet microscopiseerende oog. Het oog krijgt daardoor een doelwit om naar te zien, en kan gemakkelijk geopend blijven Van lieverlede late men het papier zakken, totdat het oog gemakkelijk zonder dit doelwit geopend en op oneindig ingesteld kan blijven. Optische samenstelling: Om bacteriën duidelijk te kunnen zien, werke men met z.g. „nat systemen" (immersie lenzen), die in combinatie met oculairen de gewenschte vergrootingen geven: Voor Zeiss als objectief de Homogene Immersie '/I2 als oculair No. 4 » Leitz » » » .. V12 „ „4 „ Reichert als „ „ „ „ '/12 „ „ „ 4 Vergrooting + 900 maal. Stel het microscoop op de volgende wijze: a. Vlakke spiegel naar boven. b. Irisblende geheel geopend. c. Abbe'sche Condensor geheel omhoog geschoven, totdat deze stuit, (het brandpunt ligt dan voor evenwijdige stralen in het object.) d. Trek tubus uit: Voor Zeiss zonder revolver tot 160 m.M. » » met „ „ 145 „ Leitz zonder „ „ 170 „ met „ „ 152 „ Reichert zonder „ „ 160 „ » » met „ „145 „ Techniek der Instelling: 1°. Leg midden op het object een druppel ceder-olie (dezelfde brekingsindex als glas.) 2°. Leg praeparaat op objecttafel en draai nu, door middel van de groote instelschroef (rechterhand), het oog steeds van ter zijde (langs tubus) gericht op het praeparaat, de Immersielens naar omlaag, totdat deze contact met de cederoliedruppel heeft. 3°. Draai nu nog even terug (naar omhoog), totdat er nog net even contact met de cederolie bestaat; (het lijdt dan geen twijfel of ge zijt boven het praeparaat niveau. 4°. Kijk door oculair en zoek nu, door middel van de vlakke spiegel, naar de maximale lichtsterkte. 5°. Draai nu, steeds door het oculair ziende, met de groote instelschroef het objectief voorzichtig naar omlaag, totdat het object in 't zicht komt (wazig gekleurde massa). 6°. Stel nu het object fijn en scherp in, door middel van de kleine instelschroef (micrometerschroef). Het reinigen van Objectieven en Oculairen. „ . . f n . \ VOOl' Zeiss a. Xylol Of Benzine j en Leitz Utensiliën : Alcohol 96 % ) voor Reichert. b. Watten of zacht lapje (b.V. flanel). Reinig de Homogene Immersielens voorzichtig met een watje of lapje waaraan wat benzine of xylol en wrijf nog met een droog, zacht lapje na, zoodat er niets meer achterblijft. Overige objectieven en oculairen kunnen op dezelfde wijze gereinigd worden. Bewaren en insluiten van gekleurde Praeparaten. a. Xylol of Benzine. IT ..... . b. Dekglazen 18 mM. □ tensi ïen . ^ Cederolie (Immersieolie). d. Etiketten. Het reinigen: 1°. Ontdoe het praeparaat van de Cederolie door het voorzichtig met een watje, waaraan wat xylol of benzine, af te deppen. Ook kan men het in een wijdmondsch fleschje, waarin een van deze beide vloeistoffen, afspoelen. 2°. Laat praeparaat daarna drogen, totdat alles is verdampt. 3°. Plak er een etiket op, waarop naam van het organisme, kleurmethode en datum staan. De op deze wijze gereinigde praeparaten kunnen buiten invloed van LICHT en STOF, lang bewaard worden. Het insluiten: Wil men ten overvloede toch nog het praef.araat insluiten (met een dekglas bedekken), dan reinige men het eerst van de cederolie. Laat er een versche druppel cederolie (Immersieolie) opvallen, en bedek het door etn goed gereinigd (zie pag. 12) dekglas. Gewone Canadabalsam is niet aan te bevelen, daar deze meestal zuur reageert en daardoor de kleurstof wordt uitgetrokken; vooral nooit voor bloedpraeparaten gebruiken. Neutrale Canadabalsam (by Firma Dr. Grübler Leipzig, in tuben) is meer aan te bevelen. Het Gram-Praeparaat. Utensiliën : Dezelfde als voor het „eenvoudige uitstrijkpraeparaat" (zie pag. 8). Kleurstoffen: a. Carbol Gentiana Violet. Sol. sat. Gentiana Violet in alcohol 96«/o . 10 Sol. aquos. acid. Phenyl. Cristallis 1 %. . 90 b. Lugolsche oplossing. Jodii .... .... 1 In gele flesch bewaren. Jodet. kal 2 Aquae Dest. 300 C. Alcohol 96"/o d. Waterige Fuchsine. Sol. sat. Fuchsini in alcohol 96% ... 10 Aquae Dest. ... ... 90 Techniek der kleuring: De Gram'sche kleuring moet op de seconde af geschieden, dus met het horloge. 1°. Maak dun gelijkmatig uitstrijkpraeparaat en fixeer dat op de gewone wijze. (Zie pag. 8.) 2°. Kleur met Carbol Gentiana Violet 3 min. 3°. Giet overtollige kleurstof af 4°. Jood joodkalium opgieten en laten inwerken .... 3/4 min. 5°. Jood joodkalium afgieten. . . 6°. Flink spoelen in alcohol 960/0 1 min 7°. Flink afspoelen onder de waterstraal 8°. Nakieuren met Waterige Fuchsine 3 m;n, 9°. Afspoelen onder de waterstraal Techniek der kleuring: De Gram'sche kleuring moet op de seconde af geschieden, dus met het horloge. 1°. Maak dun gelijkmatig uitstrijkpraeparaat en fixeer dat op de gewone 10°. Drogen tusschen filtreerpapier en verder boven de vlam Voor degenen wier oogen weinig gevoelig zyn voor het kleurcontrast paars — rood, wordt aanbevolen inplaats der Fuchsine, Bismarckbruin = Vesuvine te gebruiken. (Vesuvine (Bismarckbruin) 3 \ Alcohol 96 0/0 30 I Aqua Dest. 70 / Theorie der gramsche kleuring. Het Jood joodkalium gaat met het Gentianaviolet een verbinding aan. Joodgentiaanverbinding (donker violetzwarto kleur), welke door sommige z.g. Gram= positieve cellen tegenover alcohol 96o/0 wordt vastgehouden, door andere z.g. Gramnegatieve cellen in de alcohol wordt losgelaten. Het Gram + (positieve, vaste) organisme is dus donker violet gekleurd, (de Joodgentiaankleur wordt behouden.) Het Gram — (negatieve, losse) organisme is dus rood gekleurd, (de Joodgentiaankleur wordt in de alcohol losgelaten en de nakleurstof, het Fuchsine aangenomen.) Onderzoek naar de bewegelijkheid der Microorganismen. Het vervaardigen van den Hangenden Druppel. Q. 24 uur oude Agar-cultuur. b. ,,Hol" geslepen object-glazen. C. Dekglazen 18 m.M. □ Utensiliën: » ,, Cl, Vaseline. £, Steriele physiologische zoutsolutie (0.85 % NaCl in water). f. Platina oogje en naald. 1°. Maak hol objectglas stofvrij (afwrijven met lap) en haal het even door de vlam. 2°. Omgeef het holletje van het objectglas door een dunne rand vaseline. Vaseline. 3°. Maak dekglas stof- en vetvrij (haal hier voorzichtig door de vlam, daar het dunne glas spoedig springt,) en leg het dekglas met de ontvette zijde naar boven op donkeren ondergrond (b.v. zwartglazen plaat.) 4°. Leg midden op dekglas, doormiddel van uitgegloeid oogje, een druppel steriele physiologische zoutoplossing. (Gebruik nooit Aqua Dest, de bewegelijkheid der bacteriën wordt hierdoor geschaad). 5°. Breng door middel van uitgegloeide, afgekoelde naald een weinig cultuur in het druppeltje. 6°. Desinfecteer naald door uitgloeien en laat even afkoelen. 7°. Verdeel nu door middel van afgekoelde naald, de cultuur gelijkmatig door het druppeltje heen, zonder daarbij de druppel zelf uit te wrijven. 8°. Gloei naald uit. 9°. Leg nu objectglas met de holle kant naar beneden gericht, op het dekglas, zoodat de holte het dekglas aan alle zijden goed bedekt, Dekglas met druppel. en draai nu het geheele praeparaat ineens om, zoodat de druppel in het holletje hangt. Dekglas met druppel. Holte. 10". Druk de hoeken van het dekglas, door middel van het pincet op het objectglas, opdat de vaseline overal goed pakt. Houdt het praeparaat altijd horizontaal in de hand, daar anders bij vertikale stand de druppel zoo licht naar beneden loopt en uitvloeit. Zie voor microscopische Instelling pag. 14—15. Theorie der methode: Micro-organismen vertoonen 2 soorten van bewegelijkheid: #» A. Eigen Beweging = De organismen (met zweepdraden — *" geeselharen) verplaatsen zich ten opzichte van elkaar, " (wentelende, kronkelende, klievende of schietende beweging) B. Brown'sche Moleculair Beweging = De organismen (zonder zweepdraden) vertoonen een schokkende, trillende beweging en verplaatsen zich niet ten opzichte van elkaar, komen meestal weer op dezelfde plaats terug. Bij twijfelachtigheid der beweging, doodt men de cultuur door chloroformdampen en vergelijkt deze dan ten opzichte eener „levende" 24 uur oude cultuur: Is de beweging der organismen van levende cultuur en i gedoode ,, gelijk ( beweging. Is de beweging der organismen van levende cultuur sterker | Eigen dan van gedoode „ ƒ beweging. Het microscopisch onderzoek van het ongekleurde praeparaat. Halve lichtsterkte. De Hangende Druppel. Optische samenstelling: Voor Zeiss als objectief de Homogene Itnmersie ]/2 a's oculair = No. 4 )> Leitz ,, i) ,, j) j> /2 i' " " ^ „ Reichert als „ „ „ „ '/2 » >1 = i> 4 Vergrooting + 900 maal. Stel het microscoop op de volgende wijze: a. Vlakke spiegel naar boven. b. Irisblende geheel geopend. c. Abbe'sche Condensor geheel omhoog geschoven, totdat deze stuit, (het brandpunt ligt dan voor evenwijdige stralen in het object.) d. Trek tubus uit: Voor Zeiss zonder revolver tot 160 m.M. „ „ met „ „ 145 „ „ Leitz zonder „ „ 170 „ met „ „ 152 „ „ Reichert zonder „ „ 160 „ „ „ met „ „ 145 „ Techniek der instelling: Bij het instellen van het „hangende drappel-praeparaat", loopt men altijd groot gevaar, het objectief door het dunne dekglas heen te draaien. Indien men de volgende voorzorgen precies in acht neemt, zullen de kansen voor het breken van het dekglas uiterst gering zijn. 1". Breng wat cederolie precies op de „hangende druppel". 2°. Leg het „Hangende Druppel" praeparaat op de objecttafel en draai nu met de groote instelschroef het oog steeds van ter zijde (langs tubus) gericht op het praeparaat, het objectief naar omlaag, met de linkerhand (tusschen duim en wijsvinger) het objectglas steeds een weinig bewegende, totdat het praeparaat door de Immersie even wordt geklemd, (ge weet nu zeker het praeparaat niveau voorbij te zijn). Onmiddellijk ophouden, niet verder naar omlaag draaien, anders drukt het objectief het dekglas stuk. Zorg zooveel mogelijk waaneer het objectief het praeparaat klemt, dat de Immersielens precies op de druppel staat. 3°. Kijk door oculair en zoek nu, door middel van de vlakke spiegel, eerst maximale lichtsterkte en sluit daarna pas de Irisblende tot op + de helft, zoodat er halfdonker ontstaat. 4". Blijf door oculair zien, Houdt praeparaat met de linkerhand (tusschen duim en wijsvinger) vast, om het eventueel te kunnen verschuiven als de druppel ten opzichte der Immersielens toch niet gecentreerd mocht zijn, en draai nu, door middel van de micrometerschroef de Immersie langzaam naar omhoog, totdat het object duidelijk zichtbaar wordt, (kleurlooze dansende bacillenzwerm): Men draaie daartoe de kleine instelschroef: «. wanneer deze op zijde is aangebracht naar zich zelf toe. k- v van achteren .. „ van rechts naar links, tegenovergesteld aan de klokwijzers. Wanneer het object op deze wijze toch gepasseerd mocht zijn, dan herhale men vooral de geheele instelllngsmethode van voren af aan; (draai vooral nooit zonder eenig technisch houvast heen en weer, er bestaat dan groote kans door het dekglas heen te draaien.) Mocht ondanks al deze voorzorgen, toch het dekglas stuk worden gedraaid, zoodat de glassplinters aan de Immersielens kleven, dan reinige men het objectief voorzichtig. (Zie pag. 10). Is het lnfectleus materiaal dan wrij ve men nog na met wat carbol (acid : phenyl 8%) ot alcohol 60 %. Met hangende druppel-praeparaat kan niet bewaard worden. Onderzoek op Indolvorming. Indol (C8 H7 N) is een van de eindproducten der eiwitsplitsing, evenals het Skatol of Methylindol (C9 H9 N.) Sommige bacteriën hebben het vermogen uit eiwitachtige lichamen b.v. pepton, lndol te produceeren. Men late hen daarvoor bij voorkeur groeien in suikervrije, eiwitrijke vloeistoffen (liefst steriele 1 o/o pepton (Witte) '/2 % NaCI in water). Hierin late men de bacteriën minsten» 2 X 24 uur bij gunstige temperatuur groeien. lndol reactie volgens Ehrlich. ') Vereischte Réagentia: Paradimethyl-amidobenzaldehyd 2 Gr. I Alcohol 96 % 190 „ Realen. HC1 concentratuni 40 „ | Persulfas Kalicus (K2 Ö2 Os) D .. . . . I Reagens als verzadigde waterige oplossing 3 (oxydatie raiddel). Techniek der methode: lü. Neem van peptonwatercultuur 2 deelen (giet + de helft der cultuur uit buis in bakje; vang de langsloopende druppel met wattenprop op.) 2". Voeg Reagens A toe / deel 30 Voeg Reagens B toe / deel Bij aanwezigheid van lndol roode verkleuring der geheele vloeistof. Denkbeeldige halveering der cultuur i) Dr. A. Böbm<\ Centralbl. für Bakt. Abt. I orig. Bd 40. 1906. 1 deel Reagens B 1 deel Reagens A Theorie der Reactie: Het Paradimethyl-amido benzaldehyd verbindt zich met het Indol tot Rosindol, hetwelk in dit geval een leuco — (witte) base eener roode kleurstof is, die gemakkelijk door oxydatie (Reagens B) in deze kleur is over te voeren. Deze reactie is karakteristiek voor Indol, en is zoo gevoelig dat 7l000*000 Indol er nog mede kan worden aangetoond. Indol reactie volgens Kitasato-Salkowsky. ') Vereischte Reagentia: H2SO4 concentratum. KNO2 (Nitris Kalicus) 0.02 % opl ossing in water. Techniek der methode: 1°. Voeg bij + 10 ccm peptonwatercultuur eenige druppels H2S04 concentr. 2°. Houdt buis schuin en laat voorzichtig schuin 1 ccm KN02 oplossing indruppelen. 3". Houdt buis voorzichtig recht en kijk op scheidingsvlak, daar waar reagentia met de cultuur-vloeistof Samenkomen. Bij aanwezigheid van Indol rood violette ring. Theorie der reactie: Indol + HN02 (Salpeterigzuur) geeft een roode verkleuring. Het H2S04 maakt nu het HN02 uit het zout KN02 vrij, waardoor het HN02 zich gemakkelijk met het Indol kan verbinden. '/ïoo-ooo Indol kan er nog mede worden aangetoond. Deze reactie is niet karakteristiek voor Indol; ook andere stoffen kunnen een roode verkleuring geven, (Skatol-karbonzuur). Nitroso-Indol reactie of Cholerarood reactie volgens Dunham") - Salkowsky.') Vereischt Reagens: H2SO4 concentratum. Techniek der methode: 1°. Giet bij peptonwatercultuur scheutje H2S04 concentratum. Bij aanwezigheid van Indol roode verkleuring der geheele vloeistof. 1) E. Salkowsky. Vircbow's Archiv Bd CX 1887. S. Kitasato. Zeitschr. f. Hyg. Bd 7 1889. 2) E. Dunham. „ „ Bd 2 1887. Theorie der Reactie: Vibrionen in het algemeen zijn denitrificeerende organismen; zij zullen dus de nitraten die in het Keukenzout aanwezig zyn, afbreken tot nitrieten; hier is dus een extra toevoeging van KNO2 overbodig. Het door henzelf gevormde nitriet NaN02> verbindt zich nu met het toegevoegde H2S04, waardoor het HNO2 (salpeterigzuur) vry komt. Het HNO2 verbindt zich nu met het Indol en geeft de roode verkleuring. Het kleuren van Zuurvaste organismen. (Bac. Tuberculosis - Bac. Leprae - Bac. Smegmatis Bacteriënsporen enz. enz.) Sporen-kleuring volgens Klein. ) Eenigszins gewijzigd door M. VAN RIEMSDIJK. a. 24 uur oude aardappel- of agarcultuur. b. Steriele reageerbuis. ..... c. physiologische zoutsolutie (0.85 % NaCl in water). Utensilièn : d. Objectglazen. e. Platina oogje. f. Glaspotlood. Kleurstoffen en Reagentia: a. Carbol Fuchsine ) Zie pag. 19. b. h2so4 1% C. Waterig Methyleenblauw Of j Zie pag. 19. Loeffler'8 Methyleenblauw J Techniek der methode: 1°. Doe in steriele reageerbuis' + 1 ccm steriele zoutsolutie. 2°. Neem met uitgegloeid, afgekoeld oogje wat van de cultuur, en wrijf dit uit in reageerbuis, even boven de vloeistof tegen den glaswand aan. Wanneer alles goed is fijngewreven, wordt het van lieverlede met de zoutsolutie vermengd. De suspensie moet ongeveer melkwit zien. 3°. Gloei oogje uit. 4°. Voeg ongeveer evenveel Carbol Fuchsine toe, als dat er bacillen suspensie is. i) Alex. Klein. Centralbl. für Bact. Abt. I orig. Bd 25, 1899. 5°. Verwarm nu de roode suspensie in waterbad van ± 80 a 90° C 10 m.n 6°. Laat de vloeistof afkoelen en uitzakken; laat daarvoor de buis in vertikalen stand staan. Kleurstof neerslagen, enz., zakken naar den bodem en de bovenste vloeistoflagen zullen veel helderder van kleur worden. 7°. Maak nu van de bovenste, heldere vloeistoflaag (roer vooral niet) gewone uitstrijkpraeparaten (eerst oogje water en daarna 1 oogje roode suspensie) wrijf flink Uit, droog en fixeer op de gewone wijze. (Zie pag. 8) . . 8°. Ontkleuren in 1"/q H2S04 (even indoopen) voor Bac. Subtili» 1 a 2 sec. voor Bac. Anthracis 3 a 4 sec. 9°. Afspoelen onder de waterstraal 10°. Nakieuren met Waterig Methyleenblauw 5 min. of » » Loeffler's „ 2 min. 11°. Afspoelen, drogen en bekijken. (Zie pag. 8 en 9). . Is bet praeparaat mislukt, dan kunnen van dezelfde suspensie telkens nieuwe praeparaten worden gemaakt. Zie nog voor het nakieuren pag. 21 onder 11° . Sputum onderzoek. Dubbelkleuring van Ziehl - Neelsen voor T uberkelbacillen. a. Diep bord met zwarten bodem. (Lak met spiritusvernis bodem zwart. Of neem glazen photographieschaal en plaats deze op zwarten ondergrond Utensiliën: . ™art papier). D. Ubjectgiazen. C. Platina oogje. d. Glaspotlood. Kleurstoffen en Reagentia: 1 A.cid Phenyl. Cryst. ... s a. Carbol Fuchsine. ^qlf6 Dest 100 Fuchsim 1 J Alcohol 96 % .... io b. H2S04 5 % || Ontkleuringsmiddelen. C. Alcohol 60 o/o j Sol. Sat. Methyleenblauw in d. Waterig Methyleenblauw. ( alcohol 96 % .... io I Aquae Dest 90 of | Sol. Sat. Methyleenblauw in Loeffler's Methyleenblauw. , alcoho1 96 % ... . 30 I /10000 Hydras Kalicus (KOH) 100 ' (1 ccm 1% KOH op 100 water). Techniek der methode: 1°. Maak 2 objectglazen stof- en vetvrij meng dit met voedingsvloeistof door voor- , H zichtig heen en weer bewegen der buis. Verd. 3. 3°. Giet buis I geheel uit in steriele Petri'sche schaal 1 ^ » „ " „ „ „ „ „ „ 2 0p de vo'sende » I" .. „ „ „ „ „ 3 I wiJ'ze: Techniek van het uitgieten: 3°. Giet buis I geheel uit in steriele Petri'sche schaal 5. "Vang langsloopenden druppel op. 6. 7. Draaiende beweging der buis. Geheel indrukken van den wattenprop. 8. 9. Voorzichtig heen en weer zwenken. Naam en verdunning v/h materiaal. Datum van het gieten der plaat. 4°. Laat de platen op vlakken ondergrond stollen (pl.m. 15 min.); plaats daarna de agar bij 37° C. bodem van plaat naar boven, dus omgekeerd. — De gelatine bij 24° C. deksel van plaat naar boven. Zie voor het onderzoek en het afenten der colonies pag. 28. Theorie der methode: Vloeibare gelatine of agar, met steeds sterker verdund materiaal geënt. Petri'sche schalen met uitgegoten voedingsbodem. Er wordt steeds minder bacteriSnmateriaal in den vloeibaar gemaakten, vasten voedingsbodem gebracht (er ontstaat dus een sterke verdunning). Door het plotseling uitgieten in schalen (sterke vergrooting van het oppervlak) worden de organismen van elkaar gerukt (gescheiden) en blijven door het stollen van den voedingsbodem op die plaats gefixeerd. Zij gaan nu uitgroeien tot een colonie, welke een voor hun soort typische vorm kleur en inwendige structuur vertoont. a* Vorm, uitwendige- en inwendige structuur en kleur der colonievormen, van de verschillende micro organismengroepen vaststellen. b. Het al of niet peptoniseerend vermogen der bacteriënDoor middel van deze soorten (vervloeiing der gelatine) vaststellen. methode kan men: c. Door het tellen der colonies, ongeveer het aantal bacteriën vaststellen, dat in een bepaalde vloeistof-hoeveelheid aanwezig is d. Door het afenten der verschillende coloniën „Reinculturen aanleggen. Het onderzoek der Gelatine- en Agarplaten en het af-enten der Colonies. Het macroscopisch onderzoek der Platen: Bij voldoenden groei kan men dikwijls al macroscopisch, desnoods met behulp eener gewone loupe de verschillende voriïlCll en structuur der colonies vaststellen. Bij „vervloeide" gelatine houde men de plaat horizontaal in de hand, en bekijke de colonies door het even oplichten van het deksel. Bij niet vervloeide gelatine en agarbodems houdt men de platen gesloten en vertikaal in de hand, met den bodem naar zich toe en gekeerd naar het volle licht. Het microscopisch onderzoek der Platen. Halve Lichtsterkte. Om bacteriën coloniën te kunnen zien, werke men met „zwakke vergrooting", dus met z.g. „droog-systemen". Optische samenstelling: Voor Zeis» als objectief A als oculair No. 2 of 4 | vergrooting „ Leitz „ „ No. 3 „ „ „ 2 of 4 pl.m. „ Reichert 3 „ „ „ 2 of 4 ) 50totlOOmaal. | Dezelfde Stand van de onderdeelen van het microscoop. , als op J pag. 14. l°.a. Bij „vervloeide voedingsbodems" (gelatine) plaatst men het bakje op de objecttafel zonder deksel. b. Bij „niet vervloeide voedingsbodems" (agar — gelatine, enz.) plaatst men de gesloten schaal met deksel op de objecttafel, bodem naar het objectief toegekeerd. (Omgekeerd dus). 2°. Zoek eerst maximale lichtsterkte (zie pag. 15) desnoods kan men de Abbèsche Condensor eruit nemen, noodig is dit niet) en sluit de irisblende tot op de helft, zoodat er halfdonker ontstaat. 3"- Houdt de plant met linkerhand omvat (om kleine bewegingen te kunnen maken, voor het centreeren der colonie) en draai, door oculair ziende (met rechterhand) het objectief naar omlaag, totdat zich duidelijk rond omschreven, georganiseerde lichaampjes vertoonen. Het afenten der Colonies tot het aanleggen van Reinculturen: a. Platina naald. b. Steriele agar (in reageerbuizen schuin). Utensiliën: c. Glaspotlood met fijne punt of Fijne pen en inkt. Het aanstrepen der colonies: Wanneer men bij macroscopisch- of macroscopisch onderzoek (zie pag. 28), verschillende typen van coloniën onderscheidt, dan moeten deze op de een of andere wijze worden aangeteekend, om ze later te kunnen afenten: I. Bij vervloeide voedingsbodems: a. Macroscopisch onderzoek (zie pag. 28) de colonie onder het bakje door (aan bodem) aanstrepen. b. Microscopisch onderzoek (zie pag. 28) is het aanstrepen niet mogelijk, hier moet meteen worden afgeënt. II. Bij niet vervloeide voedingsbodems: a. Macroscopisch onderzoek (zie pag. 28) door gewoon aanstrepen aan bodem, met glaspotlood of pen en inkt. b. Microscopisch onderzoek (zie pag. 28) terwijl men door oculair ziet, aanstrepen onder het objectief door; hiervoor het beste pen met lange punten. Het af-enten der colonies : I. Bij vervloeide voedingsbodems: Deksel. | a. Macroscopisch = De schaal wordt geopend door het gewoon aflichten van het deksel. Met de platina naald wordt de colonie afgestoken en op agar-agar geënt, (voorzichtig met naald streep trekken over de schuine agar-oppervlakte). Bodem. b. Microscopisch = De open schaal staat op objecttafel en nu wordt, terwijl men door oculair ziet, met de platina naald de gewenschte colonie afgestoken en overgeënt. II. Bij niet vervloeide voedingsbodems: a. Macroscopisch = De schalen worden geopend en de coloniën afgestoken op de volgende wijze: Bodem. 2. Gloei platina naald uit in de vlam en laat deze afkoelen. (Zie pag. 2 onder 4). 1. Deksel. - ' ' Steek colonie voorzichtig af. 3. Gebruik hier de platina naald. 4. 6. Ent de colonie op agar, door met de naald voorzichtig een streep te trekken over de agar-oppervlakte. (Zie pag. 3 onder 5). b. Microscopisch = Plaats bakje open op objecttafel en ent af als onder I b. (Pag. 30). De Agglutinatie Reactie. Brengt men Immuunserum met een homologe bacteriënstam (Suspensie in zoutsoiutie) samen, dan ontstaat er een „agglomeratie" (hoopjesvorming) en „immobilisatie'' (totale bewegingloosheid) der bacteriën, een biologisch proces dat als „agglutinatie" bekend staat. De agglutinatie-reactie kan op tweeërlei wijzen uitgevoerd worden, al naar de herkomst van het te onderzoeken materiaal: Agglutinatie I. Reactie van Gruber-Widal. Ficker's Diagnosticum ^ , , = doode bacillen of Onbekend serum (serum patiënt) + bekende bacillen. Goed agglutineerbare reincultuur = levende bacillen. Agglutinatie II. Bekend serum (Konijnen immuunserum (gedroogd in den handel) + onbekende bacillen. (Bacillen van patiënt). Microscopische Agglutinatieproef (Oriënteerende — qualitatieve methode). a. Gegradueerde pipet van 24 deelen (zie Hoofdst. Macrosc. Agglut. onder a). b. „Holgeslepen" objectglazen. c. Dekglazen 18 mM, □ d. Vaseline. e. Platina naald en oogje. f. Physlologlsche zoutoplossing. (0.8S % NaCI in water). Colonie van plaat ) Agglutinatie II. of g. u uur. Goed agglutineerbare reincultuur \ I 24 uur oude agar-cultuur. \ J Agglutinatie I. \ Ficker's Diagnosticum. ) ) 1 Serum patiënt (zie onder i „macrosc. agglut.") ) Agglutinatie I. 10 mGr. Konijnen - immuunserum (droog) i van hoogen titer (zie onder i „macrosc. agglut.") I Agglutinatie II. Techniek der methode: 1°. Maak van serum een verdunning 1:100; eerst een verdunning 1:4 = 1 deeltje vloeibaar serum en 3 deeltjes zoutsoiutie of 10 mQr. droog Konijnenserum en 4/10 ccm zoutsoiutie (zie onder „Techniek der Serumverd."); vervolgens hiervan een verdunning 1:25 = 1 deeltje van verd. 1:4 en 24 deeltjes zoutsoiutie = verd. 1 :100. Bekend serum (Konijnen immuunserum (gedroogd in den handel) + onbekende bacillen. (Bacillen van patiënt). 2°. Maak nu een gewoon „hangende druppel" praeparaat (zie pag. 12 tot punt 4) en rangschik de druppels op de volgende wijze: a. Leg met uitgegloeid oogje eerst een druppel zoutsoiutie op het dekglas. b. Leg daarnaast met uitgegloeid oogje een druppel serum 1:100 op het dekglas. Serum 1 :100. Zoutsoiutie (controle). 3°. Neem nu met uitgegloeide, afgekoelde naald een weinig cultuur en laat er een vlokje van uitvloeien: a. in druppel zoutsoiutie I Nooit airlderSOfm' daar de zoutsoiutie anders met > serum besmet zoude worden en de proef daardoor k* » » serum j waardeloos zou z\jn. Heeft men als materiaal plaat-colonies (agglut. II) dan gebruikt men alt\jd 1 colonie voor beide druppels, anders is er geen zuivere vergelijking tusschen controle en serumdruppel mogelyk. 4°. Gloei naald uit en laat afkoelen. 5°. Meng nu de bacteriën met de naald gelijkmatig door de druppels heen: a. eerst door de zoutsoiutie druppel. \ „. „ , _ Zie pag. 13 punt 7. b. dan „ „ serum ,, ' nooit andersom. 6°. Sluit dekglas in als onder punt 9—10 pag. 13. 7°.a. Bekijk het praeparaat /macroscopisch (met loupe, desnoods met afgeschroefde frontlens van een oculair). b. Bekijk het praeparaat /mcroscopisch (zie pag. 14) stel hier eerst de controle-drappel in (zoutsol. en bacillen); men draaie nu daarna niet het objectief omhoog, maar verschuift het objectglas, terwijl men door oculair ziet onder het objectief door, naar den serumdruppel toe, die in de meeste gevallen dan ook tevens is ingesteld. Indien de agglutinatie in pl.m. 10 min. niet duidelijk zichtbaar is, is het wenscheiyk het praeparaat voor 5 è. 10 min. in de broedstoof van 37° C. te plaatsen; de druppels zullen niet indrogen, mits de vaseline het dekglas overal goed afsluit. Theorie der methode: 1°. Het optreden van „agglutinatie" laat zich door middel van deze methode dikwijls al op tweeërlei wijzen vaststellen: A. Macroscopisch! bacteriën laten zich moeielijk met het immuunserum vermengen. Vlokjesvorming (agglutinatie). AeneZoutsolutire-m | De bacteriën laten zich gemakkelijk met de zoutsoiutie druppel. | vermengen. Homogene-suspensie (controle). Aniuti- | Se™m nat,e" | bacillen. Zoutsoiutie I -f- l Controle, bacillen. I Deze reactie treedt al dikwijls op, wanneer men bezig is het bacteriën-materiaal in de druppels te verdeelen. Dit umacroscopische" verschijnsel der „microscopische agglutinatieproef" vertoont zich lang niet constant, ook dikwijls niet wanneer de agglutinatie microscopisch toch duidelijk positief is. Zij treedt alleen dan op, wanneer het immuunserum bijzonder werkzaam en krachtig is. De bacteriën in het immuunserum ver- "j B. Microscopisch. toonen een „hoopjes" vorming, en verlies j Agglutinatie, van iedere beweging. Aspect van Serum en Zout- bacteriön in de zoutsoiutie vertoonen \ solutiedruppel. hetzU een eigenbeweging, hetzij een ' Controle (geen Brown'sche moleculair beweging. ) AggIut,natle)- 2°. Indien geen Agglutinatie optreedt, vertoont zich het volgende: Bacteriën in het serum vertoonen eigenbeweging of Brown'sche moleculair beweging. „ in de zoutsoiutie „ „ „ „ Geen 'Agglutinatie. 3°. Indien „Auto" (spontane) Agglutinatie optreedt vertoont zich het volgende: Bacterien in het serum vertoonen ,,hoopjesvorming" en verlies van iedere beweging. „ in de zoutsoiutie „ „ „ ,. » ff 11 .,Auto" Agglutinatie. Men vergete NOOIT de ,,Controle"druppel, daar anders de proef WAARDELOOS wordt. Het is wenscheiyk de serum-concentratie bij deze proef nooit sterker te nemen dan 1:100; bij 1:50 heeft men kans dat de „normaal" agglutininen een rol kunnen gaan spelen, die dan de proef zeer in waarde doen verliezen. De qualitatieve agglutinatieproef laat zich alleen gebruiken : A. Bg uiterst weinig bacterien-materiaal (colonietje van plaat). B. Als „orienteerende" proef, om te zien of er al dan niet Agglutinatie optreedt. Grootere diagnostische waarde mag men aan deze methode nooit hechten. Voor het serologisch diagnostiseeren van micro-organismen, het uitsluiten van „groep"- en „mede"agglutinaties is alleen de „quantitatieve" agglutinatieproef te gebruiken. Macroscopische Agglutinatieproef = Diagnostische — Quantitatieve methode. II b a. Serologische Pipet in 24 deelen verdeeld volgens M. VAN RIEMSDIJK. >) 4/ io ccm Het vervaardigen der Pipet: a. Glasbuis van 5 mM. buitenmaat (z.g. ,,buigbuizen") b. Maatstokje in cM. en mM. verdeeld. C. „Zaagvijltje" of driekantig vijltje (verkrijgbaar in iederen gereedschap winkel). d. Olie. 6. Glad ovaal puimsteentje of zandsteentje. (In den handel als : „Gamburger toiletpuimsteen", verkrijgbaar bij ieder drogist of kapper). Uten.lllën; f Gewoon potlood. g. Zwarte spiritus-vernis (bij drogist) of „Stroohoedenlak" (bij drogist v. Winsen, Vijzelstraat 122). h. Fijne pen in penhouder. i. Zuigslang (dikwandige roode slang) doorsneemaat 4x13. j. Watten. k. Geëikt maatglaasje van 3 of 5 ccm, waarvan iedere ccm in 10 streepjes is onderverdeeld, met vlakken bodem. ') Zie voor literatuur: M. VAN RIEMSDIJK, Ned. Tijd. v. Geneesk. 1ste Helft 1917. 2) Wil men met kleinere vloeistof-quantiteiten arbeiden, dan neme men volgende maten: 4 mM. Glasbuis (buitenmaat) zuigslang 3x9. (1 deeltje 21 mgr.) 3 „ „ „ „ 3x9. (1 deeltje = 17 „ ) Deze serologische pipetten in verschillende maten verkrijgbaar b\j: Instrumenthandel Salm, Keizersgracht 664. 1°. Breek 16 cM. van glasbuis af (meet met cM. maatje 16 cM. af, geef daar met vijltje een snijdend krasje, en breek het stuk glasbuis op die plaats af. 2°. Vijl het afgebroken ruwe uiteinde bij; (Strijk op „zaagvijltje" wat olie, leg) sluit beide uiteinden met watten af, I glasbuis op tafel en vijl er nu langs, opdat geen olie of steenschaafsel in ] lange streken makend, totdat het uit-| de pipet dringt. (einde rondom gelijk is. ) 3 . Polijst het bijgevijlde uiteinde op puimsteentje, (houdt pipet vertikaal op het steentje en schuur nu by). 4 . Maak pipet over de geheele lengte mat, strijk daartoe met glad puimsteentje flink over de buis heen, in de lengte, totdat de oppervlakte duidelijk mat is. 5°. Leg cM. maatstokje langs pipet, zoodat het 1ste streepje precies gelijk komt met het uiteinde der pipet, en zet nu met potlood op het matte gedeelte, bij iedere % cM. een streepje, tot 12 cM. toe; er zijn dus 24 deeltjes van cM (dit vooral uiterst NAUWKEURIG). 6°. Trek nu de potloodstreepjes over met pen waaraan spiritusvernis, zooals afbeelding, en laat goed drogen (pl.m. 5 min.) 7°. Neem zuigslang en sngdt er 4>* cM. af. 8°. Maak mondstuk <5* cM. van glasbuis 5 mM.) en doe aan uiteinde een wattenpropje (met te stijf). Wanneer uiteinde zeer oneffen is, zoodat de vinger niet goed kan afsluiten, dan vflle men ook dit even bij. 9°. Pas de 3 pipetdeelen in elkaar zooals onderstaande afbeelding. 10°. Doe in maatglaasje 4/10 ccru, zuig dit met pipet op, en zet daar een streepje. Wanneer de streepjes nauwkeurig zijn gezet, zijn de deeltjes ook alle even groot Dit is te controleeren, door 1 deeltje in de pipet te laten loopen, dit opwaarts te laten glijden (zie „Het inhevelen en opglijden der deeltjes.'), in zoutsolutie te doopen, het deeltje steeds door de nakomende zoutsolutie op te laten loopen, en dan te zien of alle deeltjes gel\jk zyn. B(j gebrek aan spiritusvernis voor de streepjes, kan men zich met gewoon potlood zeer goed behelpen. 11°. Bereken. de pipet op „vrij uitloopen"; zuig daartoe telkens de 24 deeltjes op en laat vrij uitloopen tegen wand van agglutinatiebuisje aan. Meet nu met cM maatstokje langs pipet (vertikaal) hoeveel streepjes vocht er telkens achterblijven (van onderrand van meniscus afgerekend); is dit getal altijd hetzelfde, dan plaatst men dit met cM. maatstokje boven de streep 24 en zet daar ook een streepje. (Zie nog „Het toevoegen der bacillen-suspensie). b. + 15 Agglutinatiebuisje» in Leg de reep filtreer- rekje. papier op rekje, prik er C. Filtreerpapier (reepen lengte gaatjes doorheen, over- van rekje en iet» breeder eenkomende met de dan rekje). openingen in het rekje. d. „Zaagvijltje" of driekantig ƒ In iederen gereedschap-i vijltje. l winkel te krijgen. ƒ Utensiliën: e. Platina oogje. In reageer- Behoeft | f Physiologische zoutsolutie. buizen of niet steriel , J kolfje. ( te zijn. J g. Vaseline. t Doode bacillen, t Ficker'. in den handel Aggluti- A. ' ' te kragen bij} BB. Diagno8ticum. j Merck j natie 1. y te Darmstadt ) B. Suspensie van levende bacillen in zoutsolutie : 2 a 3 Agarculturen (24 uur oud). 10 a 12 ccm zoutsolutie in 1 reageerbuis. Zorg dat het condenswater niet over de cultuur loopt, deze moet zoo droog mogelijk blijven. , _ ... Strijk nu met oogje de cultuur van de Agar Bacillen af> begin onij0iaan (boven condenswater) en suspensie. maak lange streken tot boven waar de cultuur eindigt. Dit telkens herhalende, kan men soms de geheele cultuur op eenmaal aan het oogje krijgen. "Wrijf nu de cultuur met oogje uit tegen wand van reageerbuis, even boven de zoutsolutie, totdat alles goed fijn is gewreven, en meng dan van lieverlede met de zoutsolutie. De suspensie moet ongeveer melkwit zien. Agglutinatie I en II. Vloeibaar Serum (van patiënt). Agglut. I. Ontnemen van bloed bij den patiënt: Bloedlancet van Francke (zie „Het Bloedpraeparaat"). Zeepspiritus of water en zeep. Alcohol 96o/o. I. Serum. Aether. Agglutinatie- of centrifugeerbuisje. 1°. "Wrijf naald van lancet flink af met alcohol en aether. 2°. Desinfecteer oorlelletje (afwrijven met zeep spiritus, daarna met alcohol en aether), en laat goed drogen. 3°. Steek lancet op de gewenschte diepte in de huid; laat het mesje er even in, trek terug en vang het afvloeiende bloed in buisje op (1 a 2 ccm). Meestal krijgt men uit oorlelletje een vrij groote hoeveelheid bloed, ruim voldoende voor agglutinatie. 4°. Kn\jp bet wondje tusschen watten toe, en laat propje watten er aan kleven. 5°. Maak het bloed-coagulum in buisje, met platina naald los van den glaswand, het serum kan zich dan veel gemakkelijker afzetten. 5 a 10 min. centrifugeeren, bespoedigt de serumafzetting zeer. 6°. Hevel het serum met pipet van het coagulum af, en doe het in agglutinatiebuisje. Mocht het serum sauguineus zijn (bijmenging van roode bloedlichaampjes), dan centrifugeert men opnieuw, en hevelt weer al. Droog Serum : Agglut. II. Gedroogd Konijnen-immuunserum van hoogen titer (1:10000 — 1:20000). In den handel te krijgen by: Sachsisches Serumwerk Dresden. i. Serum. 1°- Geef met vijltje snijdend krasje aan kop van Vervolg. serumbuisje en breek de kop eraf. 2°. Weeg op balans 10 mgr. af en doe dit in agglutinatiebuisje. 3°- Smelt het serumbuisje in lagen vlam weer geheel toe. Het oplossen van het droge serum. 1°- Het gedroogde serum heeft 10 x zooveel vocht verloren, is dus 10 x sterker dan in normalen opgelosten toestand. Men moet dus 10 x zooveel vocht toevoegen om het serum weer op normale sterkte te brengen, dus: 10 mgr. (i/100 ccm) serum + ■/,„ ccm zoutsolutie Het verdient de voorkeur meteen een 4-voudige verdunning samen te stellen, er is dan meer vloeistof en het oplossen gaat veel vlugger, dus: 10 mgr. gedroogd serum -f- 4/10ccm zoutsolut. = Verdunning 1:4. (Zie nog pag. 85 onder 10o.) 2°. Los de serumcristalletjes zoo goed mogelijk op, wrijf de stukjes met oogje tegen den glaswand fijn, totdat het een homogene suspensie geworden is. 1) ') Indien het oplossen zeer bezwaarlijk gaat, is een kort verblijf bij 87° c. wenschelijk. Eenige wenken voor het gebruik der gegradueerde serologische Pipet: Het uitspoelen en reinigen der Pipet: I. Houdt pipet in linkerhand, klem rand van het caoutchouc aan de pipetz\jde, tusschen duim en wijsvinger der rechterhand, en trek caoutchouc en mondstuk eraf. II. Houdt pipet vertikaal onder de waterstraal, laat het water er flink doorloopen en plaats caoutchouc en mondstuk erop dezelfde wyze weer op. III. Verwijder het achtergebleven water er door blazen uit en sla er de allerlaatste vochtdeeltjes uit, door pipet energiek heen en weer te bewegen (uitslaan). Veeg pipet van buiten met filtreerpapier af. Het inhevelen en opglijden der Pipetdeeltjes : IV. Houdt agglutinatiebuisje schuin in linkerhand. V. Breng pipet in de vloeistof en hevel (kantel buisje een weinig meer horizontaaal), de gewenschte hoeveelheid in de pipet; sluit daarna pipet van boven af met wijsvinger. VI. Kantel nu de geheele pipet om (mondstuk naar beneden), neem wijsvinger af, en laat het deeltje opvlijden tot pl.m. 1 a 2 deeltjes verder, en sluit daarna van boven weer met wijsvinger af. Indien het opglijden moeielyk gaat, dan zyn hiervoor 2 oorzaken: 1°. öf de wattenprop in het mondstuk is veel te styf, 2°. öf de pipet is inwendig niet voldoende gesmeerd, er is weerstand in het kanaal, (vet- NaCl cristalletjes, zandsteen schraapsel) enz. Spoel daartoe de pipet met verdunde alcohol door; spoel daarna flink met water door en laat enkele deeltjes telkens in pipet op en neer glijden, totdat deze a. h. w. door hot lumen „vliegen". Kleven er cristalletjes aan den wand, dan is een uitstekend middel met stalen breipen, heen en weer door het lumen te wreven. Voordat men met de eigenlijke reactie begint, overtuige men zich eerst, dat waterdeeltjes gemakkelijk en vlot op en neer glijden. VII. Doop pipet nu in buis zoutsolutie (houdt deze schuin), neem wijsvinger van boven af, en laat nu de gewenschte deeltjes zoutsolutie inloopen, (hoe meer deeltjes, hoe dieper de pipet in de zoutsolutie gedoopt moet worden) en sluit weer van boven af. Bij het uithalen der pipet, late men deze langs rand van buis gleden, voor het opvangen der vloeistofdeeltjes, welke van buiten aan de pipet zyn blijven hangen. Het uitloopen der afzonderlijke Pipetdeeltjes. VIII. Omgeef pipet ter hoogte van het 1ste deeltje met wat vaseline (dun laagje); de deeltjes vloeien dan veel gemakkelijker af. IX. Breng de van boven met vinger afgesloten pipet tot op bodem van het schuin in de hand gehouden agglutinatiebuisje, de vloeistof loopt dan af; trek nu steeds pipet een weinig terug, zoodat er steeds even contact met de uitloopende vloeistof is, de vloeistof wordt dan uit de pipet geheveld. Het laatste druppeltje pl.m. 1/4 deeltje, de capillariteit van pipet 5 mM., moet uitgeblazen worden. Men kan ook de buikjes in rekje laten staan, de pipet in het buisje brengen de monding schuin tegen den buiswand houden en de deeltjes op deze wijzo' laten afvloeien. (Deze methode verdient alleen de voorkeur b(j het gebruik van „kleine buisjes"), er blijft anders te veel vocht aan den glaswand hangen. Het uitblazen : Voor het uitblazen behoeft men volstrekt niet het mondstukje i„ den mond te nemen, als men er tegen blaast, is het resultaat precies hetzelfde. Het hevelen der laatste vloeistofdruppels uit het buisje. X. Breng pipet tot op bodem van buikje, zuig even aan het mondstuk (een klein trekje) en kantel nu meteen buikje en pipet om (buisje naar boven - pipet naar beneden): de vloeistof tot den laatsten druppel toe, hevelt nu in de pipet Of men houdt buisje en pipet horizontaal, breng nu rand van pipetmonding tegen rand van agglutmatiebuisje aan, en schenk a.h.w. de vloeistof uit buisje in pipet. J Het ophevelen en uitloopen der 24 deeltjes bacillen Suspensie : Men kan hier op tweeërlei wijzen te werk gaan: A. Zuig de suspensie op tot „uitloopstreepje" | Het verdient aanbeveling de : en laat dan vrij uitloopen. i ProP *n mondstuk stijver aan I te drukken. B. Trek caoutchouc wat omhoog en breng de pipet in de suspensie, houdt do reageerbuis schuin - b«na horizontaal in de hand en laat de vloeistof gewoon .nloopen, telkens reageerbuis meer schuin houdend. Men behoeft niet bang te zijn dat de suspensie daarbij uit de buis loopt, dit behoeft met een beetje voorzichtigheid nooit te gebeuren. Het verdient aanbeveling het „Ficker'sche Dtagnosticum," na schudden ook in reageerbuis te schenken, de suspensie is dan homogener; in het fteschje blijft er zoo licht wat op den bodem. Het ophevelen van „levende" bacillen-suspensie : Het verdient aanbeveling, ook met het oog op het latere desinfecteeren zich een tweede zelfde pipet samen te stellen, niet gegradueerd en langer: ' 1°. Neem van zelfde glasbuis (ö rnM. buitenmaat) 20 cM. af. 2o. Plaats er alleen het cijfer 24 (12 X * cM.) op en maak daar even mat. (zie pag. 35 onder 4) 3o. Bereken op „vry" uitloopen (zie pag. 35 onder 11). 4o. Klem pipet in het caoutchouc der fijn gegradueerde pipet en spoel met water door, voor het gebruik. Het ophevelen gaat precies hetzelfde als onder A en B. Wil men ten overvloede nog nagaan of de 24 deeltjes der gegradueerde pipet gelflk z(jn, aan de 24 deeltjes der „lange'' pipet, dan zuigt men er do hoeveelheid der 24 deeltjes der gegradueerde pipet in op, en vergelijkt. Het desinfecteeren en steriliseeren der Pipetten: De pipetten kunnen in den stoomsterilisator ontsmet worden, zonder dat de gradueering eraf gaat: doe de pipet daartoe zonder caoutchouc in reageerbuis en sluit deze met wattenprop af. Het desinfecteeren kan ook in sublimaat — creoline — lysol geschieden, men late de pipet daarin een poos staan. B\i het verrichten der reactie met verschillend bacteriën-materiaal op hetzelfde tijdstip, is zeer aan te bevelen de pipetten tusschen de verschillende reacties in, ter desinfectie even in warme glycerine te doopen: neem reageerbuis met glycerine, verwarm boveu de vlam tot 150—180° C. (kookpunt 290° C.) en laat de gebruikte pipet er even in staan. De bacteriën zijn dan spoedig gedood. Theorie der Serumverdunningen: In ieder buisje komt 1 pipetdeeltje der serumverdunning en 24 pipetdeeltjes bacillensuspensie. Ieder serumdeeltje wordt dus door de bacillensuspensie al 25x verdund (1 en 24 deeltjes). Voor het berekenen der eigenlijke serumverdunningen, moet men dus ieder totaal verdunningsgetal dooi* 25 deelen, om te weten hoe iedere eigenlijke Serumverdunning moet worden samengesteld. Plaats nu op filtreerpapier (zie pag. 36 bij c.) onder de opvolgende buisjes, de volgende totale verdunningen, waaronder de deeling door 25, de eigenlijke serumverdunningen komen te staan: Totale Serumverdunningen = Bacillen-suspensie + Serumdeeltje. 24 ditjes 1 — 2—3 4 — 5— 6 — 7 — 8 — 9 —101c bac.susp. I - + O O — O O O O O — O —- O — O)o ditje ser.- verdunn. (contr.) - 1:50 - 1:100 - 1:250 - 1:500 - 1:1000 - 1:2500 - 1:5000 - 1:10000 - 1:2000< Ser.-dltje *onder 1:2 - 1:4 - 1:10 - 1:20 - 1:40 - 1:100 - 1:200 - 1:400 - 1:800 bac.susp- = eigent. 24 dl. — 2 dl. — 1 dl. — 2 dl. — 1 dl. — 1 dl. — 2 dl. — 1 dl. — 2 dl. — 1 dl. serum- hacill verdunn. SUSp. Van Van Van Van Van Van van van van Hoofdser.- 1:4 1:4 1:20 1:20 1:40 1:200 1:200 1:800 1:800 verdunn). Men drage zorg nooit meer dan hoogstens 2 serumdeeltjes in buisje der „eigenlyke" serumverdunningen te doen (zie „eigenlijke" verd. 1:10 — 1:100 — 1:400) er wordt daardoor wel een heel kleine fout gemaakt, deze is echter zoo uiterst gering, dat zij practisch geen waarde heeft. (Anders zoude het zyn, als men b.v. voor verd. 1:200 10 deeltjes van 1:20 zoude nemen). Men stelt zich nu z.g. „Aoo/rf-serumverdunningen" samen, waarmede dan de „eigenlijke-serumverdunningen" worden vervaardigd: Plaats nu onder 5 afzonderlijke buisjes, desnoods in 2de rekje, de volgende „hoofd-serumverdunningen": Theorie der Serumverdunningen: In ieder buisje komt 1 pipetdeeltje der serumverdunning en 24 pipetdeeltjes bacillensuspensie, leder serumdeeltje wordt dus door de bacillensuspensie al 25x verdund (1 en 24 deeltjes). Voor het berekenen der eigenlijke serumverdunningen, moet men dus ieder totaal verdunningsgetal door 25 deelen, om te weten hoe iedere eigenlijke Serumverdunning moet worden samengesteld. Plaats nu op filtreerpapier (zie pag. 36 bij c.) onder de opvolgende buisjes, de volgende totale verdunningen, waaronder de deeling door 25, de eigenlijke serumverdunningen komen te staan: Totale Serumverdunningen = Bacillen-suspensie + Serumdeeltje. 1 — 2— 3 4 — 5—6 — 7 — 8 — 9 — 10 I e & O O— O O O O O — O — O — O I ® (contr.) - 1:50 - 1:100 - 1:250 - 1:500 - 1:1000 - 1:2500 - 1:5000 - 1:10000 - 1:20000 12 3 4 5 0 0 0 0 0 | sefsinq Hoofd verd. 1:4 i- 1:20 — 1:40 — 1:200 1:800 1 dl. _ l dl. _ l dl. _ 2 dl. 2 dl. vloeib. ser. van 1:4 van 1:4 van 1:40 — van 1:200 + + + + + 3 dl. zoutsol. 4 dl. 9 dl. 8 dl. 6 dl. of zoutsol. zoutsol. zoutsol. zoutsol. lOmgr.gedr. ISvoudigel 110 voudigel (övoudigel (4voudigei serum en l verd. ƒ \ verd. ƒ \ verd. j \ verd. i 4/',o ccm zoutsol. Techniek der Serumverdunningen: Het vervaardigen der „Hoofd"-Serumverdunningen : 1°. Reinig pipet en spoel deze uit als onder 1, II, III, pag. 38. 2°. Omgeef pipet van onderen met vaseline zie VIII, pag. 38. Vervaardig de „hoofdserumverdunningen"; voorbeeld van verd. 1:4. (1 dl. serum en 3 dl. zoutsol.) 3". Neem 1 deeltje vloeibaar of opgelost serum (zie IV, V) en laat dit opglijden (zie VI pag. 38). 4". Veeg pipet voorzichtig met filtreerpapier van onderen af, zoodat er geen serumdeeltjes van buiten aan blijven kleven. 5°. Laat 3 deeltjes zoutsolutie in pipet loopen (zie VII pag. 38); men heeft nu in de pipet de geheele verdunning 1:4. 6°. Laat de geheele verdunning uitloopen in agglutinatiebuisje (zie IX pag. 38) en schudt het buisje ter vermenging. Het verdient aanbeveling de ledige agglutinatiebuisjes naast zich neer te leggen, en dan met verdunning en al in rekje te plaatsen, tenzij men met „kleine buisjes" werkt, (zie pag. 39 bovenaan). 7°. Spoel pipet grondig uit (I, II, III pag. 38). Maak nu de overige hoofdverdunningen op precies dezelfde wijze. Het vervaardigen der „eigenlijke" Serumverdunningen : 8°. Wanneer de „hoofd-serumverdunningen" allen gereed zijn, maakt men daarvan de „eigenlijke" verdunningen, door telkens de „hoofdverdunning" over te brengen in de buisjes der „eigenlijke verdunningen" (zie pag. 40). Telkens pipet goed spoelen tusschen het overbrengen van iedere nieuwe hoofd-serumverdunning : Het spreekt wel vanzelf dat tusschen de verd. 1:2-1:4 — 1:10 - 1:20 — 1:100 - 1:200 — 1:400 - 1:800 niet telkens behoeft gespoeld te worden, daar zij telkens uit dezelfde hoofdverdunning worden geput zie pag. 40. Men doet goed hier telkens de verdunningen voor beide buisjes tegelijk in pipet te nemen (zie nog onder V en X pag. 38). Het verdient aanbeveling de hoeveelheid, welke beantwoordt aan de capillariteit der pipet, boven de benoodigde hoeveelheid serum in de pipet te hevelen, men behoeft dan nooit uit te blazen. Het toevoegen der Bacillen Suspensie: 9°. Laat nu in ieder buisje der „eigenlijke serumverdunningen" 24 pipetdeelen bacillensuspensie vloeien (zie A en B pag. 39). 10°. Meng suspensie + serumdeeltje(s) door de buisjes even te schudden. II". Plaats de proef nu in de broedstoof van 37° C. voor + 15 a 25 min. Het aflezen der Agglutinatieproef : 12". Bekijk de buisjes, door het rekje dicht bij het licht te houden, en telkens met een der vingers de buisjes van achteren ietwat te beschaduwen, de vlokjes Êijn dan beter te zien. Dikwijls is het bekijken met een loupe wenschelijk, (dit bij den aanvang en bij zwakke reactie). Laat de proef nu bij kamer-temperatuur staan, en bekijk opnieuw na 24 uur. Theorie der quantitatieve methode: De agglutinatie vertoont zich bij deze methode als een FIJNE vlokvorming, gelijkende op een sneeuwbui, die naarmate de serumconcentratie zwakker wordt, ook steeds fijner en onduidelijker wordt. Na langer staan, zakken de vlokjes uit, zoodat op den bodem een wit bezinksel ligt, met daarboven een veel helderder vloeistof; dit noemt men „Clarificatie." Het is van groot belang op het tijdsverloop te letten waarin- en tot welke serumverdunning de reactie optreedt. Het snellere of langzamere optreden der reactie, by tegelük aangestelde proeven tusschen „aanverwante" organismen (Typhus — ParaTyphus) kan dikwijls een duidelijke aanwijzing geven, welke ten gunste kan uitvallen van het organisme dat het eerst en het krachtigst de reactie vertoont. Dit reactie-verschil, dat in den aanvang optreedt, kan dikwijls na enkele uren geheel genivelleerd (ingehaald) worden, en zoo worden dat zich het omgekeerde beeld kan gaan ontvouwen. Bij de agglutinatie reactie kan men 8 mogelijkheden verwachten: A. Er treedt agglutinatie op : Homogene Zoutsolutie suspensie ®een bacillen AggIuti" (Controle) natie. Serum | Vlokvorming + [ bacillen ) Agglutinatie. B. Er treedt geen agglutinatie op: Homogene Zoutsolutie suspensie *een bacillen Aggluti" (Controle) natie. Serum I Homo«e'>e I y suspensie Igeen Agglutinatie. C. Er treedt „Auto" (spontane, pseudo) agglutinatie op: Vlokvorming i Zoutsol. = i + ,,Auto" | bacillen Agglutinatie. ((Controle) Serum I VI°kvormi„g + , „Auto" )acillen f Agglutinatie. Bij het optreden van een „spontane" (Auto) agglutinatie is de proef diagnostisch waardeloos. Bij sommige reacties (lang: niet b\j elke) ziet men volgende eigenaardigheid: De agglutinatie is by zwakkere serumconcentratie b.v. 1:500 — 1:1000 sterker dan bij de Sterkere „ „ 1:100 — 1:250 Dit verschijnsel staat als „remming" bekend, en wordt toegeschreven aan onbekende stoffen welke „remmend'' op de agglutininen werken, in de „sterkere" serumverdunningen echter zoo worden verdund dat zij op den achtergrond treden, en de agglutininen niet meer beïnvloeden. Voor de reactie van Widal, vooral in den aanvang der ziekte, heelt men nooit een zeer hoogen titergrens van het serum te verwachten; een verdunning tot 1:1000 — 1:2500 is doorgaans ruim voldoende. Door het opvoeren van deze quantitatieve agglutinatie reactie tot den „titergrens" van het serum (m.a.w. de kleinst mogelyke serumconcentratie, waarbij nog agglutinatie met een homologen stam optreedt), het bepalen van het tijdsverloop waarin de agglutinatie optreedt, is het uitschakelen van mede- ol groepagglutinaties van aanverwante organismen (Typhus en Coligroep — Dysenterie en Pseudo Dysenterie — enz. enz.) mogelijk, waardoor deze reactie van groote waarde wordt, voor het% diagnostiseeren van Infectieziekten, (Typhus — Para-Typhus — Cholera — Dysenterie — Meningitis — Septichaemieën Pyaemieën) enz. enz. Het Bloed-Praeparaat. (Malaria plasmodiën - Spirochaeten - Trypanosomen - Bacteriën Bloedcellen - enz. enz.) a. Bloedlancet volgens Francke. Of gewoon lancet, mesje of naald. ontnemen van b. Zeepspiritus (of zeep en water). Bloed. C. Alcohol 96 % d. Aether. e. Watten. Laat deze pl.m. 1 uur f. Ontvette objectglazen, te voren in alcohol Voor 96% vertikaal staan. voor het , , ,, , uitstrijken van g. Objectglazen met „geslepen randen. u rx i i 10 .. _ II Ook tevoren in II den h. Dekglazen 18 mM. □ || alcohol 96% || Bloeddruppel. Utensiliën . j, Linnen lapje (zakdoek). „ , . . . , 1 Voor het Bakje of potje waarin de praeparaten op hun { v/k kant staande, kunnen worden gefixeerd. ƒ Bloedpraepar. k. Schaaltje waarin de praeparaten kunnen worden gekleurd, en wat gesloten kan worden, (b.v. groote Petri'sche schaal). Leg op bodem 2 glazen staven (desnoods l po' looden),waar- Voor het op de praeparaten kun- , , nen worden gelegd (zie — — kleuren van teekening). het Bloed- 1. Maatglaasje van II Voor het mengen en op- II praeparaat. pl.m. 10 ccm. || druppelen der kleurstof. || m. Filtreerpapier. n. AquaDe.tillata. ||Vooral niet zuur reageerend.|| Al het glaswerk, enz. enz. wat voor het „Bloedpraeparaat" wordt gebruikt, moet uitermate zuiver en rein zjjn, en geen spoorzuur bevatten. iri . rr ^ Azur 11 3.0 gr. Kleurstoffen: /M (Vl , Methyleenazur verkrijgbaar Chloorhydraat blj Firma A. Chromatin-Meurstoi ^ u + -- Q g Dr. Grübler te volgens Methyleen- Leipzig, al9 blauw ..Giemsa lösung „Giemaa". ') Chloorhydraat ) für die In donker bewaren (in het Glycerine {Chem pulver} 250.0,, Komanowsky licht dissocieert dekleurstoft. Methylalcohol {Kahl]>aum} 250.0 ,. mrbuDg" Voor het kleuren losse men in goed gereinigd, niet zuur reageerend maatglas op I ccm Aqua Dest. + ƒ druppel „Giemsa". \ ( Even voor de eigenlijke 9 ccm Aqua Dest. + / ccm „Oiemsa". 1 kleuring sara6nstell"nMeng dit voorzichtig door hoen en weer zwenken van het maatglas. Het praeparaat nloet hier vooraf wel worden gefixeerd (zie pag. 48). Voor Parasieten die moeieljjk kleurstof opnemen en voor wie dus een langdurige kleuring noodig is (sommige spirochaeten o.a. spir. Pallida), verdient het aanbeveling tot bespoediging der kleuring wat Alkali bij de kleurstof te voegen: Voeg b(j 10 ccM van het Aqua. Dest. 5 A 10 druppel, eener 10/ Kaliumcarbonaat oplossing. B. Kleurstof volgens „Kiewiet de Jonge". 2) ) Azur 11 (Gr li bier) 40 mgr. } Eosine . . 25 ,, Gewijzigde Giemsa'sche Kleurstof. j Methylalcohol . 25 ,. Het praeparaat behoeft hier vooraf niet te worden gefixeerd (zie pag. 48). | ..Giemsa'sche kleurstof" C. Snelkleurstof volgens „Giemsa".3) J -f -- I Aceton puriss. De praeparaten mogen voor deze kleurmethode in goed afgesloten niet ouder zyn dan 2x24 uur. flesch lang te bewaren. Het praeparaat behoeft hier vooraf niet te worden gefixeerd (zie pag. 48). Het gereedmaken van Object- en Dekglazen. Het „gewone" (grove) objectglas wordt voor het eigenlijke praeparaat gebruikt. verkrijgbaar bij Firma Dr. Grübler te Leipzig, al9 „Giemsa lösung für die Romanowsky farbung." 1) Giemsa. Centralbl. für Bact. Abt. I Orig. Bd. 87 1904. 2) Kiewiet de Jonge. Tropische Ziekten v. d. Indischen Archipel deel 1. v. Schilling. Das Blutbild und seine Klinische Verwertung. Jena 1912. Het „geslepen" objectglas wordt voor het uitstrijken van den bloeddruppel gebruikt. Het „dekglas" wordt voor het levende praeparaat of voor eventueele insluiting van het droge praeparaat gebruikt. Object- en Dekglazen welke voor het „bloed-praeparaat worden gebruikt, moeten uitermate rein zijn (stof- en vetvrij). 1°. Haal de objectglazen (4 of 6 per patiënt) uit de alcohol, houdt deze met pincet even in de vlam (afbranden der alcohol) en wrijf ze voorzichtig na met linnen lapje. De dekglazen kunnen niet worden afgebrand (springen); men wrijft ze voorzichtig met linnen lapje af. (Vooral nooit hard afwrijven, het glas wordt dan electrisch en trekt duizende stofjes aanj De op deze wyze gereinigde glazen zijn voldoende vet- en «tofvrvj. Voor transport wikkele men de goed gereinigde glazen in „filtreerpapier''. 2". Leg de glazen vlak neer, met de gereinigde zijde naar boven, zoo dat men ze gemakkelijk kan grijpen, dus met de randen over de tnfpl hppn<;tppkpnHe. Op deze wijze kan men gemakkelijk de tegenovergestelde glasranden tusschen duim en wijsvinger nemen. (Neem nooit het glas zelf tusscben de vingers). Het ontnemen van Bloed: Aangewezen plaatsen = Oorlelletje - Volairzijde Vingertop - Plantairzijde groote teen (vooral bij kleine kinderen). 1°. Desinfecteer lancet met alcohol en aether (flink afwrijven). „ de huid „ zeepspiritus of zeep en water, daarna met alcohol en aether en laat goed drogen. 2°. Breng lancet op de gewenschte diepte in de huid, laat deze er eenige seconden in, en haal dan terug. De eerst afvloeiende druppel gebruikt men niet, wrijf deze af met watten. De volgende bloeddruppels zijn voor het onderzoek te gebruiken. Vloeit er zoo goed als geen bloed at, dan mag nooit, indien er tenminste tevens een bloed formule moet worden gemaakt, door druk of knijpen (stuwingl, meer bloed worden verkregen. Veeg daartoe wondje en omgevende huid flink met aether af; dikwijl* komt er dan door de ontstane vaatprikkeling, meer bloed; is dit toch niet het geval, dan moet tot een nieuwe incisie worden overgegaan, Het „levende" Bloed-praeparaat. 1°. Neem de tegenovergestelde randen van het dekglas tusschen de vingers. 2°. Raak met dekglas (midden), de afvloeiende bloeddruppel even aan en laat het dekglas meteen op objectglas (midden) vallen (vooral niet aandrukken). Desnoods randen van dekglas omgeven met vaseline om de snelle verdamping tegen te gaan. 3°. Dadelijk microscopisch onderzoeken (zie pag. 14). Men behoeft hier niet zoo voorzichtig in te stellen, aangezien het geen „Hangende druppel'' is. By langdurig onderzoek, legge men het praeparaat op „verwarmde" objecttafel (37 o C.). Het „gekleurde" Bloed-uitstrijkpraeparaat. Het uitstrijken: 1°. Neem tegenovergestelde randen van objectglas tusschen de vingers. 2°. Raak nu met objectglas (uiteinde) de afvloeiende bloeddruppel even aan en strijk deze nu met korten kant van „geslepen" objectglas gelijkmatig en snel uit, nadat eerst duidelijk voeling (contact) tusschen glasrand en druppel is verkregen (zie teekening). Men vege rand van „geslepen" objectglas voor ieder nieuw praeparaat telkens goed af, of neme telkens een nieuw glas. Van lederen patiënt worden minstens 2 & 3 praeparaten gemaakt. Wanneer de bloeddruppel goed is uitgestreken, moet het praeparaat eruit zien, alsof het objectglas door een dun gelijkmatig vliesje is bedekt (dit eerst door veel oefening). Bij gebrek aan „geslepen" objectglazen voor het uitstrijken, kan men ook heel goed slap carton (briéfkaart — visitekaartje) gebruiken. Met deze uitstrijk methode beschadigt men de bloed-elemer,ten het minst, daar de druppel achter den rand van het objectglas aan wordt voortgesleept, zonder dat er in het minst op de bloedcellen wordt gedrukt. Het drogen. 3°. Laat de praeparaten aan de lucht goed drogen, en wacht daarna nog + 5 min., alvorens tot de eigenlijke kleuring over te gaan. Het bewaren van „ongefixeerde" Bloed-uitstrijkpraeparaten. Wil men nog niet tot kleuring overgaan, zoo wikkelt men de goed droge praeparaten in filtreerpapier en sluit ze weg in stopflesch, waarop bodem Chloorcalctum (overdekt met filtreerpapier) of Chlorcalcium in hollen stop. (Zorg vooral dat de praeparaten nooit met het Chloorcalclum In aanraking komen). Het Fixeeren. Dit is alleen noodig voor praeparaten die met kleurstof A (zie pag. 45) worden behandeld; overbodig is het voor de kleurstoffen B en C, aangezien daar de fixatie vloeistof (methylalcohol en Aceton) reeds In de kleurstof aanwezig is. 4°. Fixeer nu de goed droge praeparaten in: Methylalcohol + 3 a 5 min. of Absolute aethylalcohol ■ ■ ■ ■ + 15 a 20 min. In eeslot6n of bak^e- Absolute aethyl alcohol-aether aa + 10 a 15 min. Fixeer vooral nooit in de vlam, de bloedcellen worden dan zeer geschaad. 5°. Laat de praeparaten goed drogen, eerst vertikaal laten uitdruipen op filtreerpapier en dan de alcohol rustig laten verdampen. De fixatie-vloeistoffen kunnen meermalen worden gebruikt, mits zij in goed gesloten stopflesschen worden bewaard. Het kleuren: 6°. Druppel uit maatgiaasje Kleurstof A (zie pag. 45) op het gefixeerde praeparaat en laat inwerken . . . pl.m. 15 a 30 min. of Druppel uit maatgiaasje Kleurstof B (zie pag. 45) op het ongefixeerde praeparaat en voeg er dadelijk evenwel Aqua Dest. (uit ander maatgiaasje) aan toe; meng dit door met objectglas of iets anders over de vloeistof heen te strijken, en laat inwerken pl.m. 15 a 30 min. of Druppel uit maatgiaasje Kleurstof C (zie pag. 45) op het ongefixeerde praeparaat en laat inwerken . . pl.m. V2 « 1 min Voeg daarna evenveel Aqua Dest. (uit ander maatgiaasje) toe, merg dit door met objectglas of iets anders over de vloeistof heen te strijken en laat inwerken pl.m. 5 a 10 min. Voor Spirochaeten (b.v. Pallida) moet de kleuring met de kleurstoffen A en B worden uitgestrekt tot 1 & 2 uur, soms nog langer. (Zie nog pag. 46 onder A). Het afspoelen en drogen : 7°. Spoel nu 1 praeparaat onder de waterstraal kort af, droog tusschen schoon filtreerpapier en onderzoek microscopisch (zie pag. 9). Blijkt de kleuring voldoende te zijn, dan spoele- en droge men de overige praeparaten op dezelfde wijze; is zij niet voldoende, dan late men de andere praeparaten langer kleuren en controleert ze dan microscopisch, na verschillend tijdsverloop, een voor een. 8°. Het microscopisch onderzoek en het bewaren en insluiten der Praeparaten zie pag. 9—10—11. „Dikke druppel" methode tot het opsporen van enkele parasieten in het Bloed, volgens Ross') - Dempwolff. Voor deze methode mag hef Bloedpraeparaat niet ouder zijn dan 24 uur, anders fixeert het vanzelf. 1". Breng groote, dikke bloeddruppel op objectglas; strijk deze nu heel weinig uit (i a 2 cm. breed), zoodat er een dikke bloedlaag op het objectglas ligt. 2Ü. Laat praeparaat goed drogen (desnoods in broedstoof 37° C.) 3°. Er wordt nu niet gefixeerd, maar volgende sterk verdunde Giemsa-oplossing op het praeparaat gedruppeld: 2 ccm Aqua Dest + 1 druppel „Giemsa", laat inwerken pl.m. 20 min. Giet kleurstof af en druppel nu een nieuw gemaakte hoeveelheid van zelfde kleurstof op het praeparaat en laat inwerken r>l m ia ■ pl.m. 30 min. 4». Spoel nu niet onder de waterstraal (het praeparaat zou worden weggespoeld), maar voorzichtig in schaaltje met water. 5". Droog niet tusschen filtreerpapier, maar laat praeparaat vertikaal op filtreerpapier uitdruipen en drogen. Theorie van deze methode. Voor het opsporen van heel enkele parasieten is het onderzoek eener groote hoeveelheid bloed, die gemakkelijk kan worden overzien, noodzakelijk; vandaar het „dikke druppel" praeparaat. Door de inwerking der sterk verdunde Giemsa'sche kleurstof', treedt het „Maemoglobine" uit de ongefixeerde erythrocyten (Haemolyse), waardoor de bloedlaag doorzichtig wordt. De enkele parasieten die nu ook tevens gekleurd zijn geworden, zullen ons nu, omdat de „dikke druppel" doorzichtig is geworden, niet licht ontgaan. i) R. Ross. Centralbl. för Eact. Abt. I Ref. Bd. 36, 1905. Theorie der methoden : Het „levende" Bloedpraeparaat." Het „levende" Bloedpraeparaat wordt in hoofdzaak vervaardigd om de verschillende soorten van beweging der elementen (bloedlichaampjes) en parasieten te kunnen bestudeeren. (Voor Trypanosomen — Spirochaeten — Plasmodiën zeer typisch). Het „gekleurde Bloed-uitstrijkpraeparaat." Het „gekleurde" Bloed-uitstrijkpraeparaat heeft practisch de grootste waarde: 1°. Voor het diagnostiseeren van Bloedziekten (samenstellen der bloedformule). 2°. „ n aantoonen van Parasieten (Malariaplasmodiën — Trypanosomen — Spirochaeten, enz. enz.) die zich met de tegenwoordige „polychromatische" bloedkleurstoffen bijzonder contrastrijk en fraai kleuren. De Bloed-kleurstoffen z\jn zoodanig samengesteld, dat zy uit verschillende kleurende komponenten bestaan, minstens uit 1 basische kleurstof (Methyleenblauw — Methylgroen — Amethyscviolet — Pyronin, enz.) en 1 zure kleurstof (Eosine — Oranje — zure Fuchsine — Narcëine, enz ), waarvan de Chemische samenstelling een zoodanige is, dat de kleurstof „neutraal" is. De Bloedelementen in het algemeen (normale en pathologische) en de parasieten vertoonen nu een zeer verschillende affiniteit ten opzichte van deze kleurstofkomponenten, zoodat de fraaiste en meest contrastrijke differentiaties ontstaan. Alles wat zich nu met den Basischetl komponent kleurt heet Basophiel Acid ophiel j „ „ „ „ „ „ Zuren „ „ „ Oxyphiel i Eosinophiel j „ „ „ „ „ „ Neutralen „ „ „ Neutrophiel (tusschenkleur) De Giemsa'sche kleurstof is een volmaking der oude Romanowsky'sche kleurstof, welke in hoofdzaak een mengsel is van Eo»ine (zuur) en Methyleenblauw (basisch). Romanowsky zag nu, wanneer hy Eosine en Methvleenblauw in bepaalde verhoudingen mengde, dat er een „nieuwe kleurende komponent" ontstond, welke het Chromatlne (kernsubstantie) zeer fraai rood kleurde, n.m. het „Rood uit Methyleenblauw" (Azur). (Dit „Rood uit Methyleenblauw" ontstaat ook, wanneer bij Methyleenblauw Alkali wordt gevoegd „Loeffler's Methyleenblauw," zie pag. 19). In de Romanowsky'sche kleurstof zijn dus de volgende kleurstof komponenten aanwezig: Methyleenblauw = BdSOphiel (Blauw) eosine = Acidophiel (Rood) Bosniezuur-Methyleenblauw = Neutrophiel (Violet) „tusschenkleur' „Rood uit Methyleenblauw" = Chromatinophiel (Rood) (basisch). Het „gekleurde Bloed-uitstrijkpraeparaat." Het „gekleurde" Bloed-uitstrijkpraeparaat heeft practisch de grootste waarde: 1°. Voor het diagnostiseeren van Bloedziekten (samenstellen der bloedformule). 2°. „ n aantoonen van Parasieten (Malariaplasmodiën — Trypanosomen — Spirochaeten, enz. enz.) die zich met de tegenwoordige „polychromatische" bloedkleurstoffen bijzonder contrastrijk en fraai kleuren. De Bloed-kleurstoffen z\jn zoodanig samengesteld, dat zy uit verschillende kleurende komponenten bestaan, minstens uit 1 basische kleurstof (Methyleenblauw — Methylgroen — Amethyscviolet — Pyronin, enz.) en 1 zure kleurstof (Eosine — Oranje — zure Fuchsine — Narcëine, enz ), waarvan de Chemische samenstelling een zoodanige is, dat de kleurstof „neutraal" is. De Bloedelementen in het algemeen (normale en pathologische) en de parasieten vertoonen nu een zeer verschillende affiniteit ten opzichte van deze kleurstofkomponenten, zoodat de fraaiste en meest contrastrijke differentiaties ontstaan. Alles wat zich nu met den Basischetl komponent kleurt heet Basophiel Giemsa heeft nu de groote verdienste gehad, het z.g. „Rood uit Methyleenblauw" wat door Michaelis was vastgesteld als Methyleen Azur, chemisch zuiver te bereiden! Azur i = Methyleen Azur-chloorhydraat. = Methyleen Azur-chloorhydraat. 1 Azur II "f j, ~~ Methyleen Blauw-chloorhydraat. ) Dit Azur II vermengde hij nu met Eosine, Methylalcohol en Gly cerine (zie pag. 451. Door deze wijze van bereiden is de kleurstof van veel constanter samenstelling geworden en worden daardoor ook veel regelmatiger resultaten bi) de kleuring van het bloed verkregen, dan vroeger het geval was. In hoofdzaak verhouden zich nu de kleurstof komponenten dezer „Qiemsa'sche" oplossing van de Romanowsky^kleurstof als volgt: Methyleenblauw = BüSOphiel (blaUW). Eosine = Acidophiel t Eosinophiel j (roocl) Methyleen Azur = Chromatinophiel (rood), (basisch) Eosinezuur - Methyleenblauw = Neutrophiel (Violet). Bloedcellen en Parasieten kleuren zich nu met „Giemsa" als volgt: Erythrocyten _ Bleekrood. Kern . — Rood tot Violetrood. Neutrophiele Polynucle- Protoplasma- aire Leucocyten . . . korreling = Violetrood. (fijne korrels) Kem . . Rood tot Violetrood. Eosinophiele Polynucle- Protoplasma- aire Leucocyten . . . korreling ' — Rood tot Bruinrood. ! (grove korrels) Kern . , = Rood tot Violetrood. Basophiele Polynu-1 Mest- Protoplasma- cleaire Leucocyten) cellen korreling = Blauw tot Blauwviolet. (grove korrels) (Metachromatisch). I u ». I groote en I Kern . . =. Rood tot Violetrood. Lymphocyten ] ^Xine J Protoplasma — Blauw met Azurkorreling (rood). Groote Mononucleaire „ Leucocyten. .... Kern . . = Rood tot Violetrood. en Overgangscellen . . Protoplasma = Blauw met fijne Violetroode (Neutrophiele) korrelin?. Centrum-Rood. Bloedplaatjes Peripherie blauwachtig. Kernsubstantie (Chromatine) = Rood. Malaria-plasmodiën . protoplasma - Blauw. Pygment . — Bruinzwart. Kern. . . = Rood. _ Blepharoplast— Rood. I rypanosomen i , Zweepdraad = Rood. Protoplasma = Blauw. Bleekrood (Spir: Pallida) Spirochaeten Blauwviolet. Bacteriën Rood tot Blauwviolet. DRUKFOUT: BIdz. 14 staat Homogene Immersie 'ƒ2 mo0t ztin '/12 REGISTER. A. Pag. Agar-platen, afenten der colo- nies 29 Agar-platen, gieten van ... 24 „ , onderzoek van . 28 Agglutinatie 33-43 „Auto" 34-43 „ , remming der . . 44 Agglutinatie-reactie, macroscopische 34 Agglutinatie-reactie, microscopische 31 Anthracis, sporen van bac. 19 Antiformine 22 Azur I—II 51 B. Bewegelijkheid der micro-orga- nismen, onderzoek naar de 12 Bismarckbruin 12 Bloedcellen 51 Bloedlancet volgens Francke . 44 Bloed, ontnemen van. . . .36-46 Blocdpraeparaat, kleuring v/h 45-48 „ het gekleurde 47 „ het levende . 47 „ volgens Ross- Dempwolff 49 Brown'sche moleculair beweging 14 C. Carbol Qentiana violet ... 11 Cholera-rood reactie .... 17 Chrysoïdine ....... 23 D. Diphtheriebacill., poolkleuring der 23-24 Drigalsky'sche spatel .... 7 E. Pag. Eau de Javeile (antiformine) . 22 Eigen beweging 13 Eosine 45 F. Ficker's Diagnosticum . . . 31-36 Fixeeren van gewone prae- paraten 8 Fixeeren van bloedpraeparaten 48 Fuchsine, carbol 19 „ waterige 11 G. Gelatine-platen, afenten der colonies 29 Gelatine-platen, gieten van . . 24 „ onderzoek van 28 Gentiana violet, carbol ... 11 Giemsa'sche kleurstof.... 45 Grampraeparaat 11 H. Hangende druppelpraeparaat . 12 Hsngende druppel, microscopisch onderzoek .... 14 Indol 16 Indolreactie volgens Dunham- Salkowsky 17 Indolreactie volgens Ehrlich 16 „ „ Kitasato- Salkowsky 17 Insluiten van praeparaten 10 K. Kleuring volgens Giemsa . . 48 .. » Gram ... 11 „ „ Kiewiet-deJonge 48 Pag. Kleuring volgens Klein ... 18 „ „ Neisser 23 „ „ Romanowsky 50 „ „ Ziehl-Neelsen 19 Kristal-violet voor Neisser's kleuring 23 L. Leprae, bac 18 Lugol'sche oplossing .... 11 M. Malachietgroen, waterig ... 21 Malaria plasmodiën .... 52 Methyleen-azur 50-51 Methyleenblauw, waterig . . 19 „ Loeffler's . . 19 „ Neisser's . . 23 „ Oiemsa's . . 45 Methyl-Indol 16 Microscopisch onderzoek gekleurd praeparaat .... 9 Microscopisch onderzoek ongekleurd praeparaat .... 14 N. Naald, platina 1 Nitroso-Indolreactie .... 17 O. Objectieven en oculairen voor onderzoek gekleurd praepar. 9 Objectieven en oculairen voor onderzoek ongekleurd praeparaat 14 Objectieven en Oculairen, reinigen van 10 Oogje, platina 1-2-4-6 Overenten in glasdoozen . . 6 „ ,, reageerbuizen 1-5 „ „ vloeistoffen . . 1 „ oprechte voedingsb. 1 „ „ schuine „ 1 P. Petri'sche schaal 1-6 Physiologische zoutsolutie . . 8 Pag. Pipet voor serologische reacties 34 „ „ levende suspensie . 39 „ desinfectie van .... 40 Plasmodiën 44-52 Poolkleuring 23 R. Reinculturen, aanleggen van 1-7-24 Reinigen van gekleurde prae- paraten 10 Reinigen van objectieven en oculairen 10 S. Serum, droog konijnen ... 37 „ patienten 36 „ pipet voor 40 „ verdunningen van . . 34 Skatol 16 Smegmatis, bac 18 Spirochaeten, kleuring van . . 45 Sporen-kleuring 18 Sputumonderzoek 18 „ volgens Loeffler 22 „ „ NakaoAbe 21 Subtilis, sporen van bacillus . 19 Suspensie, bacillen 36 T. Trypanosomen, kleuring van . 52 Tuberkelbacillen, kleuring van 19 „ ophooping in sputum 21-22 U. Uitstrijk-praeparaat, tnicrosc. . 8 V. Vesuvine 12 W. Wattenprop, voor neus- en keelonderzoek 7 Widal, reactie van 31 Z. j Zuurvaste organismen, kleuring van .......... 18 37 36 40 34 16 18 45 18 18 22 21 19 Suspensie, bacillen 36 T. Trypanosomen, kleuring van . 52 Tuberkelbacillen, kleuring van 19 „ ophooping in sputum 21-22 U. Uitstrijk-praeparaat, microsc. . 8 V. Vesuvine 12 W. Wattenprop, voor neus- en keelonderzoek 7 Widal, reactie van 31 18