yy ^ VAN HET BACTERIOLOQISCHSi ROLOGISCH I.ABORATORIl!M Bacteriologische-Scr o logische METHODEN en RECEPTEN SAMLNGI STELD l l:N BEHOEVE VAN EEN BACn'.RlOI.OGlSCH PRACTICUM DOOR jONKVR. M, VAN RH: MS DIJK ftACï OWH OOO-SEIKH 000 MO EEN VOORWOOKD VAN PROF, l)r. R. H. SAO 1:1 Derde herziene en zeer vermeerderde druk SWETS & ZI:iTUNGER AMSTERDAM, KI ï ZERSCiRAQ 11 471 1925 ABC VAN HET BACTERIOLOGISCHSEROLOGISCH LABORATORIUM Bacteriologische-Serologische METHODEN en RECEPTEN SAMENGESTELD TEN BEHOEVE VAN EEN BACTERIOLOGISCH PRACTICUM DOOR JONKVR. M. VAN RIEMSDIJK BACTERIOLOOG-SEROLOOO Derde herziene en zeer vermeerderde druk SWETS & ZEITLINGER AMSTERDAM, KEIZERSGRACHT 471 1925 ABC VAN HET BACTERIOLOGISCHSEROLOGISCH LABORATORIUM Bacieriologische-Serologische METHODEN en RECEPTEN SAMENGESTELD TEN BEHOEVE VAN EEN BACTERIOLOGISCH PRACTICUM DOOR JONKVR. M. VAN RIEMSDIJK BACTERIOLOOG-SEROLOOG Derde herziene en zeer vermeerderde druk SWETS & ZEITLINGER AMSTERDAM, KEIZERSGRACHT 471 1925 Bacteriologische-Serologische METHODEN en RECEPTEN VOORWOORD. Jonkyrouwe M. van Riemsdijk heeft in 1916 een handleiding samengesteld voor de Studenten, die te Amsterdam den praktischen Cursus in de Bacteriologie volgden. Het keurige boekje, door goede pen-teekeningen verduidelijkt, heeft veel waardeering van onze leerlingen ondervonden. Het werd ook buiten dezen kring van belangstellenden bekend en er ontstond bij den boekhandel vraag naar. De voorraad is nu uitgeput, ongeveer 80 leerlingen per jaar hebben behoefte aan zulk een boekje en de Schrijfster heeft een nieuwe, vergroote uitgaaf gereed gemaakt. De „Bacteriologische en Serologische Recepten en Methoden", zullen ditmaal ook in den handel verkrijgbaar zijn. Ondergeteekende heeft de boekjes zien gebruiken en is getuige geweest van de groote nauwkeurigheid, waarmede het werk is verricht. Bij twijfel is geraadpleegd met onderzoekers, die meer bevoegd waren in eenig onderdeel van het werk. De teekeningen zijn sterk vermeerderd; zij munten, evenals in de eerste editie door duidelijkheid uit. Hij meent dat deze beknopte handleiding voor Laboranten, die nu reeds met vrucht door 3 a 400 Studenten bij hun werk gebruikt is, den beginnenden Bacterioloog over menige moeilijkheid, cito, tuto et jucunde zal heen helpen. R. H. SALTET. VOORWOORD 2DEN DRUK. De vraag, ook buiten het Bacteriologisch Practicum om, naar den lsten Druk van dit werkje, het verzoek van velen om deze handleiding ook voor een grooteren kring onderzoekers beschikbaar te stellen, hebben mij doen besluiten den 2den Druk van dit boekje, welke ik een weinig meer nog aan de algemeene praktijk toetste, in den handel te brengen. Deze handleiding beoogt alleen, den ««tf-geoefenden Laboratorium-onderzoeker bij zijn arbeid behulpzaam te zijn. Den Studenten, welke het Bacteriologisch Practicum volgen, wordt het boekske als van ouds van wege het Laboratorium verstrekt; zij behoeven dit dus niet vooraf aan te schaffen. Mijn groote tevredenheid wensch ik te betuigen aan den Directeur der Drukkerij „De Hoop" (St. Janstraat 31, Amsterdam), die de lang niet eenvoudige zetwijze van den tekst, zoo uiterst nauwkeurig en zoo geheel volgens mijn wensch uitvoerde. Ook over de reproducties mijner teekeningen, mijn groote waardeering en tevredenheid. In de Heeren Swets & Zeitlinger vond het boekje zijn beproefde uitgevers. Ten slotte een woord van oprechten, hartelijken dank aan allen, die mij bij de samenstelling van deze handleiding, zoowel daadwerkelijk als moreel, steunden. M. VAN RIEMSDIJK. VOORWOORD 3DEN DRUK. In 1923 reeds, werd ik door den Uitgever gemaand, zoo langzamerhand aan de bewerking van een 3den Druk te moeten gaan denken, aangezien de 2de Druk „op zijn eind" liep. Welnu, deze 3de Druk is gereed gekomen en het boekske is door verscheidene hoofdstukken vergroot. Ik meende goed te doen, aan het Microscoop, zijn bouw, iets over de theorie der lenssoorten, aan vergrootings tabellen, gebruik, behandeling en onderhoud, een plaats te moeten inruimen. Afgezien nog van enkele geheel nieuwe hoofdstukken, te weten, „het reinigen van gekleurde alcoholen" — de „massa" gram-kleuring — de reactie van Storch — de „anaerobe" hangende druppel — en verder de noodige wijzigingen, waardoor het geheele werkje aan de nieuwste inzichten getoetst werd, ondervond het Serologisch gedeelte — op verzoek — een belangrijke uitbreiding. Toegevoegd werden de adsorbtieproef van Castellani, de Complementbindings-reactie volgens Bordet-Gengou en de reactie van v. Wassermann, volgens Sormani. Aan de theorie van het „Uitvlokkings Proces" (agglutinatie, enz.), zoo zeer verduidelijkt door de moderne Colloïd-chemische inzichten, werd nog een korte bespreking gewijd. Een woord van dank aan de vertegenwoordigers der voornaamste Microscoop-firma's (Zeiss, Leitz, Reichert en Winkel), voor het verstrekken van de nieuwste gegevens, alsook voor het afstaan der noodige cliché's. De uitvoering van het werkje was wederom in de beproefde handen van den Heer Korten (drukkerij „de Hoop"), die met zijn staf van helpers, mijn wenschen zoo in alle opzichten tegemoet kwam. Dat de Heeren Swets & Zeitlinger wederom den nieuwen druk ter hand willen nemen, sluit voor mij reeds een waarborg in, van welslagen. Ten slotte nog een woord van oprechten, hartelijken dank, aan de twee onderzoekers, van wier veeljarige praktijk, ik, voor enkele zeer specialistische onderdeelen, heb mogen gebruik maken. M. VAN RIEMSDIJK. BACTERIOLOGISCHE METHODEN EN PHYSISCH-CHEMISCHE REACTIES Het Overenten. Ent- P1 . rlatina oogje instrumenten Platina naald Met het Platina oogje worden geënt: A. Schuine vaste voedingsbodems. Schuine Agar-Agar. Strijk- „ Gelatine. cultuur Aardappel, enz. enz. Strijk met oogje over schuine oppervlakte heen, zonder de voedingsbodem daarbij te beschadigen. d. Vloeistoffen: „ , . Schudt een weinig van de cultuur in de Bouillon - Peptonwater vloeistof uit; de glasstaaf mag daarbij niet Lakmoeswei - Melk - in de vloeistof komen, anders springt deze bij Rundergal - enz. enz. het latere flambeeren. C. Vaste Voedingsbodems in Glasdoozen (Petri'sche schalen of platen). Endo-plaat. Haemoglobine Soda Agarplaat. Bloed Agarplaat. Serumplaat. enz. enz. Techniek der enting zie pag. 9. Met de Platina Naald worden geënt: A. Rechte vaste voedingsbodems. Rechte Agar-Agar. Steek- „ Gelatine. cultuur. „ Neutraalrood Agar. enz. enz. Steek met naald midden in voedingsbodem tot b^na aan de glasstaaf toe, en haal dan terug. Plaats de „Gelatine" voedingsbodems nooit hooger dan bij 24° C. „ „ overige „ „ 37° „ enz. Techniek van het overenten. Het overenten heeft ten doel organismen eener cultuur rein over te planten op een daarvoor geschikten sterielen voedingsbodem, dus zonder bijmenging van organismen van buiten, (verontreiniging). Door inachtneming der volgende handgrepen, is een voldoende steriliteit gewaarborgd, om een reine overenting te verzekeren. Het overenten in Reageerbuizen (met statief). 2. Draaiende beweging der buis. Wattenprop tot op de „helft"uittrekken. 1. Draaiende beweging der buis. „Flambeeren van de kop". Steriele voedingsbodem 4. Platina gedeelte rood gloeien, glasstaaf enkele malen door de vlam halen, (flambeeren). 5. Een weinig cultuur afnemen. 6. „Streeps- of „zig-zag" gewijze uitstijken over geheele oppervlakte. 7. Uitgloeien als onder 4. Naam v. h. organisme. Datum der enting. 8. Draaiende beweging der buis. n Wattenprop „geheel* indrukken. De cultuur waarvan wordt overgeënt, wordt eerst als onder „8" afgesloten, nadat de laatste der reeks overentingen van die cultuur is geschied. 1. Draaiende beweging der buizen. Flambeeren van de „kop". 2. Draaiende beweging der buizen. Wattenproppen tot op de „helft" uittrekken. Het overenten in Reageerbuizen (zonder statief). 3. Platina gedeelte rood gloeien, glasstaaf enkele malen door de vlam halen, (flambeeren). Wattenproppen „afnemen". 6. „Overenten". 7. Wattenproppen „opzetten". 10. Draaiende beweging der buizen. Wattenproppen „geheel" indrukken. (Zie nog pag. 5 onderaan). 9. Uitgloeien als onder 3. Naam v. h. organisme. Datum der enting. Het afbranden van de Cultuur aan het Platina oogje: Sommige culturen (Tuberkelbac: - Diphtheriebac: - Vloeibare culturen) spatten wanneer men het oogje dadelijk in het heetst van de vlam brengt. Men houdt daarom het oogje eerst in het koude gedeelte der vlam (vlak bij brander) en vervolgens in het heetste gedeelte. Het vallen van den Wattenprop uit het Pincet: Wanneer de gesteriliseerde wattenprop bij het overenten uit het pincet valt, wat bij eerstbeginnenden door een spierkramp nogal eens voorkomt, mag deze niet zonder meer op de buis geplaatst worden. Houdt de wattenprop daartoe dadelijk m*>t het pincet fn de vlam; tracht nu vooral niet de vlam der brandende prop uit te blazen, (er komen dan vanuit den mond opnieuw bacteriën op), maar druk de prop !n de reageerbuis, de vlam wordt daardoor meteen gebluscht. Desnoods kan men een geheel nieuwe wattenprop van steriele buis nemen, en er zonder meer opplaatsen. Het schrijven op Glas. Het Glaspotlood (Farbstift No. 2251 Faber). Het schrijven met het z.g. „Glaspotlood" is dan alleen goed mogelijk, wanneer het glas „vetvrij" is. Voor het vetvrij maken der reageerbuis houdt men deze even in de vlam en laat daarna afkoelen. Voorwerpen die moeielijk in de vlam te houden zijn, kolven, glasschalen enz,, ontvette men, door ze af te wrijven met benzine of xylol. „Oost-Indische Inkt, Talens, Apeldoorn. Oost-Indische Inkt. „Pelikan Tusche" No. 541, örubler, Leipzig. „Perl Tusche", GiiNTHER & WAGNER. Met Oost-Indischen inkt kan zeer gemakkelijk op glas geschreven worden (pen). In water lost deze inkt echter op. Het schrijven op glas hetwelk daarna wordt gesteriliseerd. Oost-Indische Inkt en Etiketten Vernis (Firma KAT, Oude Braak 29, Rotterdam). Wil men op glas schrijven, dat daarna aan een hooge-vochtige temperatuur moet worden blootgesteld, zoo ga men als volgt te werk: lo. Verdun de Etiketten Vernis: 96^ J ^eel! 2o. Beschrijf het Glas met Oost-Indischen inkt. 3o. Laat goed drogen. 4o. Bestrijk den goed drogen O.I. inkt door middel van penseel met de verdunde Etiketten Vernis. Het vliesje vernis zal de inkt beschutten; door de, na de sterilisatie troebelig, wit geworden vernis, kunnen de O.-I. inkt-letters duidelijk worden gelezen. Papier en Potlood. Potloodschrïft is absoluut houdbaar — zelfs bij[zeer hooge sterilisatie temperaturen. Indien Kolven, Buizen, enz., niet voorzien zijn van een „mat" gemaakt gedeelte, waarop met potlood kan worden geschreven, zoo ga men op onderstaande wijze te werk. Het overenten in Glasdoozen. (Petri'sche schalen). 2. Oogje met pincet ombuigen en uitgloeien in de vlam. 4. Streepsgewijze uitstrijken. 6. Oogje „rood" gloeien. Naam v. h. organisme. Datum der enting. In plaats van het oogje wordt ook wel gebruikt: A. De Drigalsky'sche Spatel: glazen Men druppelt de aangelengde faeces staaf, of het bloed door middel van pipet op rechthoekig /Typhus ^Diagnostiekj p\aa{f en wrijft dit nu over den omgebogen geheelen plaat uit, met den uitge- (diam.: ± 5m.M. gloeiden afgekoelden spatel. B. De steriele Wattenprop aan metalen of houten Steel, in Kurk bevestigd en in Reageerbuis geschoven. ■ / Diphtherie \ Strijk de Wattenprop, waar- ^I Diagnostiek I aan keel- of neusslijm, streeps\ enz. / gewijze over de plaat heen. De techniek der enting blijft verder precies dezelfde. Het gebruik der Steriele Pipet. Wanneer een pipet moet worden gesteriliseerd en daarna in sterielen toestand eenigen tijd moet worden bewaard, zoo moet de pipet op bijzondere wijze worden voorzien. Het „inpakken" der Pipet. lo. Voorzie het uiteinde der pipet (wat door vinger wordt afgesloten) van binnen van een klein wattenpropje A (dit maakt het in- en uitioopen der vloeistof gelijkmatig, biedt vervolgens eenige beschutting bij het eventueel opzuigen van bacteriën-houdend materiaal, houdt de bacteriën uit de lucht tegen). 2o. Vervolgens wordt de pipet op onderstaande wijze ingepakt: Reageerbuis Wattenprop om het stooten der punt tegen te.gaan. Wattenprop om de bacteriën van buiten tegen te houden. A Wattenprop om de bacteriën van buiten tegen te houden. Het „uitpakken" der Pipet. (Voor het gebruik gereed maken). lo. Trek de pipet uit de reageerbuis, (houdt zoo hoog mogelijk vast), 2o. Verwijder wattenprop B. (laat propje A in de pipet) 3o. „ wattenprop C met pincet; indien men deze wattenprop door „langs glijden'- langs de pipet (langs uitmondingsgedeelte) zou willen verwijderen, zoo bestaat er groote kans de pipet, met de in de wattenprop aanwezige bacteriën, te besmetten. Het „inhevelen" der vloeistof. Strijk pipet eenige malen door de Bunsen'sche vlam (Flambeeren). 5o. Breng pipet in de vloeistof, iets dieper dan het inhoudsteeken, laat vloeistof inloopen en sluit pipet van boven met wijsvinger af, wanneer voldoende vocht is ingeloopen. Is er zeer weinig vloeistof, zoo kan men zuigen, dit echter alleen in het uiterste geval; door de reageerbuis in dit geval steeds schuiner te houden hevelt de vloeistof veel gemakkelijker in de pipet. Het „uitloopen"' der vloeistof. 60. Houdt pipet voor het uitloopen der vloeistof, met de punt tegen den wand van het vat, dat als receptaculum moet dienen (pipet moet tegen het glas rusten (contact), totdat er geen vloeistof meer kan uitloopen, op volgende wijze: De „geëikte" pipetten (d.w.z. met een bepaalde inhoudsmaat) zijn op „uitloopen" berekend, m.a.w. de fractie vloeistof welke bij bovenstaand uitloopen steeds achterblijft, is bij de inhoudsmaat berekend geworden. Iets over Kleurstoffen, Fixatie, Kleuring, Ontkleuring, Beitsing, enz.') In ongekleurden toestand, zijn Bacteriën en Weefsels microscopisch slechts gebrekkig te zien. De kleuring heeft ten doel: 1°. Cellen, enz. duidelijk zichtbaar te maken. 2°. Door de juiste keuze van kleurstoffen en ontkleuringsmiddelen bijzondere structuur eigenaardigheden duidelijker naar voren te brengen, waardoor differentieel diagnostische reacties kunnen worden verkregen. Reeds in 1875 heeft Weigert aniline-kleurstoffen voor bacteriologischeen histologische doeleinden aanbevolen; sindsdien hebben Koch en Ehrlich deze techniek tot het haast volmaakte opgevoerd. 1) Arthur Pappenheim: Grundriss der Farbchemie 1901, Hirschwald Berlin. Prof. Dr. H. Bechhold: Die Kolloide in Biologie und Medizin 1912, Verlag Theo: Steinkopff Dresden. Philipp Eisenberg: Theorie der Bacteriën-férbung. Handbuch der mikrobiologischen Technik Kraus und Uhlenhuth. Urban & Schwarzenberg Berlin 1922. Chemische indeeling der Kleurstoffen volgens Ehrlich. Naar Ehrlich zijn te onderscheiden: Basische aniline Kleurstoffen. Zure Mengsel (zout) van Basische en Zure kleurstof Neutrale „ „ Kleurstoffen welke noch Basisch noch Zuur zijn Indifferente aniline kleurstoffen (Michaelis). Rangschikking der Aniiine-Kieurstoffen. „Basische" (Basophiele) „Zure" (^pMele*) Aniline kleurstoffen Aniline Kleurstof en Zure Fuchsine 1 Waterblauw ^ „ . . Eosine > Rood China-blauw ^ Blauw huchsine j Congo-rood ) Zure Violet J Neutraalrood I D«„,i c, ' Rubine I Rood" Fluorescine | Safranine J Aurantia ^ Oranje Piknnezuur J Methyleenblauw | „Neutrale" (Neutrophiele) Aniline Toluidineblauw f Blauw. Kleurstoffen. Nijlblauw ' Romanowsky, D. i u • \ Pikrinezure Rosaniline Giemsa. Bismarck bruin 1 , Eosine - Methyleenblauw Pappenheim, ( rifrxfüXUino ) ( u,n* verbindingen May-Grünewald \ cnrysoiame / ) (voor Bloedpraeparaten) Leishman Gentiana Violet 1 enz'' enz' Methyl Violet I (noch Kristal Violet , Violet. „Indifferente" basische Aniline Kleurstoffen Thionine | noch zure) DahHa ' Sudan UI i R . } Scharlach R \ K voor het aantoonen r ... . . . , en kleuren van Groen. Drmeth^ylarmdo J Qeel Vetten (Lipoiden). Bacteriën en Kernen zijn „basophiel", kleuren zich bij voorkeur met basische aniline kleurstoffen. Protoplasma is „acidophiel", kleurt zich bij voorkeur met zure aniline kleurstoffen. Vetten zijn „indifferentkleuren zich bij voorkeur met indifferente aniline kleurstoffen. Iets over de Chemie der Kleurstoffen. Aniline Kleurstoffen zijn aromatische Koolwaterstoffen welke de Benzolkern voeren C c6 h4 nh2 Cr. , S Grond- V. De voornaamste S C H Aniline kleurstoffen ' formule _ . , . C C6 H4 NH2 van het voor Bacteriolo- ^ gische doeleinden Rosani Z1 c j-j behooren tot de \c H4 NH2 ^ Rosanilinen. C H H H Naar P. Ehrlich, bezit iedere kleurstof een z.g. „Kleurvormende Kern" of „Chromophor", een meerwaardig Atomencomplex, waaraan zoutvormde groepen kunnen worden geaddeerd. Als Chromophore-groepen kunnen fungeeren: lo. Nitro-groep (—NO2) 2o. Nitroso-groep (—NO) 3o. Azo-groep (—N=N—) 4o. Athyleen-groep (>C=C<) 5o. Nitril-groep (>C=N—) 60. Carbonyl-groep (> C=0) 7o. Azin-groep (""N—N<) Het Chromophor als zoodanig is kleurloos en reageert bijna neutraal — alleen toetreding van zure en basische zoutvormende groepen, doen het z.g. „Auxochrome" ontstaan, hetwelk kleurend vermogen bezit en op die wijze tot ontstaan der eigenlijke „kleurstof" aanleiding geeft. De kleurstofvorming verloopt in 3 Phasen:1) lo. Vorming eener Leukobasis (kleurloos) 2o. „ „ Kleurbasis (kleurloos) 3o. „ van de Kleurstof (Gekleurd) * Het „Chromophor" zelve is dus latent, kan alleen niet kleuren, het „auxochrome" maakt het echter kleurend. Voorbeeld: Het kleurlooze Benzol Ca He + chromophore Azo-groep Roodgekleurd chromophor Azobenzol (C6 H5-N = N-Cg H5) - hetwelk geen kleurstof is (geen „kleurend" vermogen). Azobenzol + „Auxochrome" (m.a.w. zoutvormende amino- of oxygroep) _ Amino-azobenzol \ of > Kleurstoffen Oxy-azobenzol J Bij de „Basische" kleurstof hebben de basische „auxochrome" (Amido groepen, Amido Karboxylen) kleurend vermogen. Bij de „Zure" kleurstof hebben de zure „auxochrome" (Sulfogroepen-NitrogroepenKarboxylen) kleurend vermogen. Bij de „Neutrale" kleurstof hebben zoowel basische als zure „auxochrome kleurend vermogen. Vrije basen en zuren der kleurstoffen worden niet gebruikt, daar zij slecht oplossen; de in den handel zijnde kleurstoffen zijn gemakkelijk oplosbare zouten van basen en zuren. Basische kleurstoffen zijn de zouten van kleurstofbasen; m.a.w. kleurstofbase en niet-kleurend zuur (Azijnzuur of HCL). Zure kleurstoffen zijn de zouten van kleurstofzuren m.a.w. kleurstofzuur en niet-kleurend Alkali (Ammoniak Na—K—Ca). Voorbeeld: Methyleenblauw is niet anders dan het zoutzure zout van het basische methyleenblauw, m.a.w. een binding van methyleenblauw en HCL. Neutrale kleurstoffen zijn de zouten van kleurstofzuren met kleurstofbasen. Indifferente kleurstoffen zijn noch zuur, noch basisch-, missen het vermogen om „zoutvormende groepen" (auxochrome) te maken. Zij zijn onoplosbaar in water, doch oplosbaar in vetten, alcohol en aether. Doordat zij met „vet-achtige stoffen" (Lipoiden) een micro-chemische reactie aangaan, wordt de kleurstof daarin vastgelegd en het „vet" gekleurd. Deze kleurstoffen dienen dan ook tevens als een reagens op vet. ') A. F. Holleman, Leerboek der Org. Chemie. Het Fixeeren. In „levenden" toestand laat het protoplasma zich zeer moeilijk kleuren (vitale kleuring), in afgestorven, ongefixeerden toestand evenzoo. Indien een „ongefixeerd" praeparaat wordt gekleurd en daarna aan een „waterspoeling" wordt onderworpen, zoo spoelt het licht aangedroogde praeparaat van het objectglas af. Het Fixeeren beoogt: lo. Praeparaat energisch aan objectglas te doen kleven. 2o. De cellen snel te dooden, zooveel mogelijk in den toestand waarin zij verkeerden. De vloeibare- en halfvloeibare bestanddeelen zoo vast te leggen, dat deze niet meer opzwellen, noch schrompelen, noch stollen kunnen, ook geen andere artefacten zich meer kunnen vertoonen. 3o. De cellen in dien toestand te conserveeren. 4o. Duor het fixeeren zoo min mogelijk structuurveranderingen te veroorzaken. 5o. Het object goed kleurbaar te maken. Voornaamste Pixatiemiddelen Droge warmte Formaline I Alcohol Acetoti CMethyl-Aethyl i 96% of 100% J Chroomzuur 1 o,u 1 i i Aznnzuur 1 % , „ Osmiumzuur 1 % JM'n' zuren | | Pikrinezuur } °r«" zuren {Kalium Natrium Magnesium Chloriden {Kwik (sublm.) Platina Zink In de praktijk wordt meestal een combinatie van bovengenoemde reagentia gebruikt. Somtijds is het fixatiemiddel reeds met de kleurstof vermengd (zie „Het Bloedpraeparaat"), zoodat fixatie en kleuring tegelijkertijd kunnen geschieden. De juiste keuze van „fixatiemiddel" en daarbij behoorende „kleurstof" is voor bepaalde cel- of weefselgroepen zeer verschillend en van groot belang. Volgens Unna zouden vele van deze „fixatiemiddelen door oxydatie (oxydeerende zuren) het reduceerend vermogen van de cellen opheffen (tegengaan dat de kleurstof door „reductie" in de „leukobase" wordt overgevoerd). Alcohol en Formol zouden juist de zuurstof van de cel vastleggen en op deze wijze de reductie tegengaan. Theorie van het Kleuringsproces. Omtrent den aard van het kleuringsproces is nog weinig met zekerheid bekend. De aanhangers der „Chemische theorie" (Ehrlich, Mayer, Flemming, Heidenhain, Unna, Michaells, Giemsa, enz.) beschouwen de kleuring zuiver chemisch, m.a.w. dat het weefsel bestaat uit „basische" en „zure" groepen, welke zich verankeren met de tegenovergestelde resp. „basische" of „zure" groepen der kleurstof; deze moeten eerst uit het kleurstofzout worden „afgesplitst", als „vrije" kleurstofbasen en kleurstofzuren, welke zich dan met de betreffende weefsel „groepen" tot een „zout" verbinden. Daartegenover staat de „Physfsche theorie" (Fischer, Appleyard, Walker, Biltz, Freundlich, Pelet Jolivet, enz.) welke de kleuring door „Adsorbtie" willen verklaren] te vergelijken met de adsorbtie van gassen en sommige kleurstoffen door dierlgke kool. Steun hiervoor is het feit dat uit sterk verdunde kleurstofoplossingen relatief meer kleurstof wcrdt gebonden, dan uit meer geconcentreerde oplossingen. Bij „adsorbtie processen" spelen „oppervlakte" krachten een groote rol en deze zijn het sterkst vertegenwoordigd bij de „Kolloïden". Weefsel en kleurstof zijn volgens de nieuwere inzichten tot de Kolloïden te rekenen. Fixatie middelen — „echte" en „onechte" Bytsmiddelen zijn van grooten invloed op de „Sol" resp. „Gel" toestand van deze Kolloïden en beslissen den graad van adsorbtie. Bij het „kleuringsproces" is de opname der kleurstof een „adsorbtie" proces, dat in vele gevallen gevolgd wordt door (Electro) chemische bindingen en reacties tusschen kleurstof en substraat. Naar gelang der kleurmethoden kunnen hetzij de Chemische, hetzij de Physische of de Kolloïd-chemische factoren op den voorgrond treden. Eiwitacht ge stoffen zijn „Chromophiel", m.a.w. nemen gemakkelijk kleurstof op. Het eiwit der Bacteriën en Celkernen is „basophiel", bezit verhoogde affiniteit tot „basische kleurstoffen" omdat deze allen meestal een „zuur" charakter hebben. Celprotoplasma is „Acidophiel" (oxyphiel) bezit verhoogde affiniteit tot „zure kleurstoffen". Dit is echter niet zoo exclusief, dat de tegenovergestelde kleurstof met in staat zou zijn, toch eenigermate een kleuring van het weefsel te bewerken. Neutrale kleurstoffen als zoodanig worden door de Bacteriën niet opgenomen, zij onttrekken daaraan de „basische" componenten. Theoretische rangschikking der Kleurmethoden. 1°. De „Progressieve" kleuring 2°. De „Regressieve" kleuring 3°. De „Samengestelde" kleuring 4°. D e „M etachromasie" De „Progressieve" kleuring (Directe of Monochromatische). Kleuring met slappe kleurstofoplossingen, welke op een bepaalde hoogte wordt afgebroken; wanneer de elementen, welke een zeer sterke affiniteit tot die bepaalde kleurstof vertoonen, duidelijk gekleurd zijn, de overige elementen eerst zwak, b.v. bacteriën zeer duidelijk, overige cel-elementen slechts zwak. Voorbeeld: Dit doet zich voor bij het „eenvoudige oriënteerende" uitstrijk-praeparaat, waar met één kleurstof wordt gekleurd, b.v. Carbol Gentiana Violet, Loeffer's Methyleenblauw, Waterige Fuchsine, enz. De „Regressieve" kleuring (Indirecte kleuring). Kleuring waarbij gedeeltelijk wordt „overkleurd", en waar door juist gekozen „ontkleuringsmiddelen'' die cellen de kleurstof wederom loslaten, welke daarmede minder „echt" gekleurd zijn, (lossere binding vormen, zwakkere affiniteit tot die bepaalde kleurstof vertoonen). Voorbeeld: ,. Bij de Gram'sche kleuring laten Gr. -(negative)cellen de kleurstof in alcohol los. houden Gr. (positieve) cellen de kleurstof in alcohol " w " " vast. Bij de kleuring van Tuberkelbacillen (Ziehl Neelsen) laten de Tuberkelbacillen (zuurvast) in zuur en alcohol het Fuchsine niet los, leucocyten en andere bacteriën (zuurlos) doen dit wel. Bij de kleuring van Diphthenebacillen (Neisser kleuring) waar de poolkorrels donker violet zijn gekleurd, terwijl het bacillenlichaam zich door „water" laat ontkleuren en het „chrisoïdine" (bruin) aanneemt. De „samengestelde" Kleuring (Polychromatische, Panoptische). Kleuring waarbij meerdere verschillende kleurstoffen tegeiykertyd (Neutrale kleurstof combinatie) of na elkaar op het weefsel inwerken. Bij de „neutrale" kleurstofcombinatie (zie pag. 13) moet minstens 1 basische en 1 zure kleurstof aanwezig zijn. Hierbij zullen de verschillende weefselgroepen die kleurstof(fen) opnemen waarvoor zij een „verhoogde affiniteit" bezitten. Voorbeeld: Bij de kleuring van „bloedpraeparaten", waar de bloedcellen, kernen en korrelingen naar gelang van hun „affiniteit" zich zeer verschillend kunnen kleuren. Bij „bacteriën", waar in het protoplasma duidelijk rood gekleurde vormsels (kernsubstantie!) te zien zijn, terwijl het protoplasma blauw gekleurd is. (Giemsa). De „Metachromasie". Onder „Metachromasie" wordt verstaan, het vermogen van Kleurstoffen, om het substraat een andere kleur te geven, dan dat de eigenlyke kleur der Kleurstof is. Voornaamste Metachromatische Kleurstoffen Methyleenblauw Azur Methylviolet Dahlia Thionine Toluidineblauw Safranine Metachromatisch worden gekleurd: | Slym Kapsels Amyloid Weefselcellen (Kernen & Granula) Volutin Vet Cytoplasma (Protozoën) Voorbeeld s Methyleenblauw en Azur Diphtheriebac.: Protoplasma — Blauw „ Poolkorrels = Rood Miltvuurbac.: Protoplasma — Blauw „ Kapsel = Rosé Bac. Megatherium „ Mesentericus Miltvuurbac. (Protoplasma = Blauw Kernsubstantie = Rose _ . , Kernen = Rood Safranine et.. , | Slijm = Geel Thionine en Amyloid =: Blauw Toluidineblauw Granula (testcellen) = Rood Bij de chemisch zuivere kleurstoffen (geen bijmenging van andere kleurstof) is de „Metachromatische kleur" altoos die der „vrije" base van het kleurstofzout, welke van bovengenoemde kleurstoffen rood is. Verklaring: Michaelis meent, dat door een „gewyzigde" rangschikking der Atomen onder invloed van het substraat, deze „nieuwe" kleur ontstaat (bv. Nijlblauw lost zich in Benzol-Toluol op met roode kleur — in Alcohol met blauwe kleur — zonder dat er van zoutvorming sprake is. Eisenberg en Hansen-Pappenheim gelooven aan een hydrolytische splitsing van het kleurstofzout, waardoor de „vrije" base, welke in het bepaalde weefsel „oplosbaar" is, op deze wijze wordt gebonden en het weefsel kleurt. De Ontkleuring. De „ontkleuring" wordt aangewend, teneinde fraaie contrasten in het microscopisch beeld te krijgen. Een „ontkleuring" is dan alleen mogelijk, wanneer de betreffende kleurstof in het ontkleuringsmiddel oplosbaar is. Algemeen principe: Hoe moeilyker een organisme zich laat kleuren, des te moeilijker laat het zich ook ontkleuren. (Zuurvaste organismen, Tuberkelbacillen, Sporen.) Hoe gemakkelijker de kleuring, des te spoediger ook de ontkleuring (bacteriën in het algemeen). Voornaamste Ontkleuringsmiddelen. Zwakke ontkleuringsmiddelen Water Alcohol Aniline Olie Ol. Caryophyllorum Aceton Glycerine (Aqua Dest.) (verschillende \ concentraties ) Kleurstoffen hieraan weerstand biedend heeten Physisch-echt / Nelkenöl, \ II \ Kruidnagelolie / II Voor Basische Kleurstoffen Voor Zure Kleurstoffen Sterke ontkleuringsmiddelen ( | HCL ] Zuren [ H2 S 04 i |hno3 Sterkste | ontkleurings- J middelen | Zuren ~b alcohol Zwakke Alkaliën f KOH (Verdund) I Na O H ( „ ) i Zeepen t Basische Zouten Zouten van zware metalen IJzerchloride Kopersulfaat Zilvernitraat Zouten van lichte metalen Natr. Sulfaat „ Chloride „ Bisulfiet Kal. Bichromaat „ Carbonaat Magnes. Sulfaat „ Carbonaat ■ax C O cz V Ex a> u O tfl *1 — O 2ü a> 1°. Wrijf in mortier de afgewogen hoeveelheid kleurstofpoeder goed fijn met een deel van het Aqua Dest. 2°. Voeg de rest van het Aqua Dest al mengende toe. 3°. Giet de oplossing in bruine flesch. 4°. Na filtratie is de oplossing voor het gebruik gereed. Voor Bacteriologisch gebruik doet men de kleurstoffen in fleschjes van 50 cM3. inhoud, voorzien van trechtertje, waarin filtertje van filtreerpapier. Reiniging der Handen van Kleurstof. Zoutzuur pl.m.20 % 1 deel i Kleurstofvlekken hiermede bestreken verdwijnen Alcohol 96 % 3 deelen I spoedig. Naspoelen in water. Voor Chrysoïdïne Vesuvine Bismarckbruin I Chloorkalk ) | Zoutzuur 10% j Chloorkalk aanmengen met water tot papje. Kleurstofvlekken met het papje bestrijken. Daarna doopen in HCL 10% (ontwikkeling van vrij CL) Afspoelen onder waterstraal. Voor Plkrinezuur 1 Lithiumf Carbonaat 0.75 % Het Reinigen van „gekleurde" Alcoholen ) volgens M. van Riemsdijk. Alcohol welke bij de kleurmethoden ter ontkleuring wordt gebruikt, neemt kleurstof op en wordt daardoor gekleurd. Deze kleuistof wordt zoo hinderlijk, dat de alcohol al spoedig ter ontkleuring niet meer kan worden gebruikt, hoewel het percentage van den alcohol nog zeer gunstig is. Op onderstaande wijze kunnen deze „gekleurde" alcoholen op eenvoudige wijze „ontkleurd" worden, waardoor zij wederom goed bruikbaar worden. Utensiliën: a. Carbo Raffinatus j |^on Pharm. Handelsver. b. Alcoholflesch met „vuilen alcohol" (mei aoorDoorue kutk, waarin tweede gaatje voor klein trechtertje. c. Alcoholflesch „ledig" 1 met doorboorde kurk, waarin zijdelingsche | inkeping (zie fig.). d. Filtertrechter j „Absaugtrichter aus Porzellan" No. 888 Liste I Allgemeine Chem. Apparate Firma Hugershoff. e. Overhevelaar Buis van ± 7 m.M. diam. 2Xrechthoekig omgebogen, waarvan I bijna op bodem van flesch D. III + 50 cM. lang. /. Stukje slang van 10 cM. lengte met klemkraantje (G en H fig.) g. Oeharde papieren filters (Iets grooter dan oppervlak filter) h. Ontvette watten. i. Gele vaseline. j. Aerometer voor „lichte" vloeistoffen. k. Thermometer. I. Maatglas van 100 cM3. Techniek der Methode: 1°. Sluit de zywaartsche monding van kraan van filtertrechter, door glasstaafje (Zie fig. bij C) in stukje zuigstang. 2°. Breng op bodem van trechter 2 geharde papieren filters-, druk die aan, zoodat er een kleine opstaande kant ontstaat, die goed aansluit. 3°. Bevochtig de filters met reinen 96 % alcohol en plet opnieuw aan. 1) M. van Riemsdyk. Het reinigen van „vuilen" alcohol. Ned. Tijd. v. Geneesk Tweede Helft No. 15 1923. 4°. Leg een flink laagje ontvette watten op de filters, bevochtig dit eveneens met reinen 96 % alcohol en plet den rand vooral goed aan. Er mag later geen kool achter glijden. 5°. Strooi met lepeltje carbo raffinatus op de watten; vul den trechter daarmede tot den rand toe; schud den trechter een weinig, zoodat de kool zich vlak verdeelt. 6°. Zet trechter op flesch E zuiver sluitend in kurkopening. 7°. Reinig trechterrand zorgvuldig van de kool (met doek). 8°. Leg boven op de kool een gehard papieren filter (moet binnen den rand blijven). 9°. Plet de kool een weinig vaster, door met stop van stopflesch voorzichtig aan te drukken. 10°. Leg op trechterrand, dikke laag vaseline en verdeel deze gelijkmatig. 11°. Leg op onderrand van het bovenstuk (B) van filter eveneens een dikke laag vaseline. 12°. Druk nu platten rand van bovenstuk trechter (B) op platten rand van trechter zelf (A) stijf op elkaar, zoodat er een zuivere adhaesie plaats vindt. 13°. Hevel den vuilen alcohol in den overhevelaar. (slangetje heeft nog geen verbinding met trechter.) Open daartoe klemkraan H, laat een ander de flesch kantelen, zoodat de alcohol uit den overhevelaar loopt en sluit nu spoedig het klemkraantje. (Zorg dat er geen luchtbellen in overhevelaar komen. 14°. Neem de losse stop uit bovenstuk trechter en laat vuilen alcohol voorzichtig door slangetje op filter loopen (open daartoe klemkraantje), totdat de reine druppels in flesch E druppelen. 15°. Zorg dat de vuile alcohol halverwege de stopmonding staat en sluit klemkraantje H. 16°. Breng nu de goed gevaselineerde stop in de monding, zorg door draaien, dat een goede adhaesie tusschen de vlakken plaats vindt. 17°. Open kraan i, verbind slangetje O aan het filter en laat nu voorzichtig alcohol inloopen, totdat de druppels met een snelheid van 90 per minuut in flesch E vallen (nfet sneller, daar anders geen voldoende kleurstof absorbtie plaats vindt). De eerste portie schoone alcohol ziet troebel (pluizen van watten enz.). Men sluit het klemkraantje H, licht den trechter voorzichtig van flesch E, en laat een ander den troebelen alcohol door het trechtertje in flesch D terug gieten, waarop de trechter wederom op flesch E wordt geplaatst en het proces opnieuw kan beginnen. Dag en nacht kan men den alcohol door laten druppelen. De sterkte van dezen schoonen alcohol wordt nu bepaald. Giet daartoe den alcohol in maatglas, zorg dat de vloeistof de temp. heeft welke op den aerometer staat (desnoods met behulp van ijskast of broedstoof). Doop den aerometer in den alcohol en bepaal het soortelijk gewicht. Bereken nu hieruit het Volume Procent met behulp van de Alcohol Tabel van Hehner (zie pag. 25). Voor de Gram-kleuring ga men niet beneden 94 % Alcohol. Wil men het Volume Procent van dezen alcohol opvoeren, zoo kan men dit door Kopersulfaat doen (CuSo4) dat men zelf anhydrisch maakt, door het blauwe poeder uit te gloeien totdat het wit ziet (in kwartsschaal of op metalen plaat). Men stort een overmaat hiervan bij den alcohol. Sluit flesch door caoutchouc kurk af, laat enkele dagen staan. Het CuSo4 wordt blauw door het aantrekken van het water uit den alcohol. Voor het gebruik filtreert men den alcohol door hard-papieren filter (sluit trechter van boven af, b.v. met glazen plaat of deksel Petri-schaal, om verdamping tegen te gaan) en bepaal daarna het soortelijk gewicht. Het gebruikte CuSo4 kan telkens wederom worden uitgegloeid en dan opnieuw worden gebruikt. Theorie der Methode: Fijne kool heeft het vermogen sterk te adsorbeeren. Door nu den alcohol langzaam door dit koolfilter te laten druppelen, zal de kleurstof + overige onreinheden door de kool volkomen worden gebonden, zoodat de alcohol wederom glashelder te voorschijn komt. Dit koollaagje heeft een capaciteit om 14 L. alcohol volkomen te reinigen. De doelmatige afsluiting van filtertrechter en overige receptacula houdt de verdamping van den alcohol tegen. De daling van het percentage van den alcohol door het gebruik bij de kleurt methoden is uiterst gering (na 4 weken ± 1 %). Deze gefiltreerde alcoholen zyn dus zeer goed wederom te gebruiken. De zoutzure- en zwavelzure alcoholen (Tuberkelbacillen-kleuringen enz.) kan men zeer goed voor reinigings doeleinden gebruiken (glaswerk enz. enz.) Tabel van het Soortelijk gewicht van Alcohol met de daaruit afgeleide Voluum Procenten bij 15° c. (water van 15 C» = 1) volgens O. Hehner. Soort. Vol. Soort. Vol. Soort. Vol. Soort. Vol. Soort. Vol. gew. % gew. % gew. % gew. % gew. % 0 9190 57.45 0.8890 70.35 0.8590 81.80 0.8290 91.46 0.7990 98.98 80 57.92 80 70.77 80 82.19 80 91.75 80 99.16 70 58 36 70 71.17 70 82.54 70 92.05 70 99.35 60 58 80 60 7 .58 60 82.90 60 92.36 60 99.55 50 5922 50 71.98 50 83.25 50 92.66 50 99.75 40 59 63 40 72.38 40 83.60 40 92.94 40 99.86 30 60.07 30 72.77 30 83.94 30 93.23 39 99.98 20 60.52 20 73.15 20 84.27 20 93.49 38 100.00 10 60.97 10 73.54 10 84.60 10 93.75 00 61.40 00 73.93 00 84.93 00 94.00 0 9090 61.84 0.8790 74.33 0.8490 85.26 0.8190 94.26 80 62.31 80 74.70 80 85.59 80 94.51 70 62.79 70 75.08 70 85.94 70 94.76 60 63.24 60 75.45 60 86.28 60 95.03 50 63.69 50 75.83 50 86.61 50 95.29 40 64 14 40 76.20 40 86.93 40 95.55 30 64.58 30 76.57 30 87.24 30 95.82 20 65.01 20 76.94 20 87.55 20 96.08 10 65.41 10 77.29 10 87.85 10 96.32 00 65.81 00 77.64 00 88.16 00 96.55 0.8990 66.25 0.8690 78.00 0.8390 88.46 0.8090 96.78 80 66.69 80 78.36 80 88.76 80 97.02 70 67.11 70 78.73 70 89.08 70 97.27 60 67.53 60 79.12 60 89.39 60 97.51 50 67.93 50 79.50 50 89.70 50 97.73 40 68.33 40 79.85 40 89.99 40 97.94 30 68.72 30 80.22 30 90.29 30 98.16 20 69.11 20 80.60 20 90.58 20 98.37 10 69.50 10 81.00 10 90.88 10 98.59 00 69.92 00 81.40 00 91.17 00 98.80 De in den handel verkrijgbare Alcoholen zijn: (Alcohol) II Spiritus Absolutu» . . • 99 100 % „ Spiritus Fortior 95% „ Spiritus 90 % „ II Spiritus Dilutus 70 % Pharmac. Ned. IV Tabel voor het verdunnen van Alcohol met water volgens Gay-Lussac. Vol. Proc. van den verdunden Alcohol Volume Procenten van den te verdunnen Alcohol bij 15° C. 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 90 6.4 85 13.3 6.56 80 20.9 13.79 6.83 75 29.5 21.89 14.48 7.20 70 39.1 31.05 23.14 15.35 7.20 I?" 6e*e . 65 50.2 41.63 33.03 24.66 16.37 8.15 s^, 60 63.0 53.65 44.48 35.44 26.47 17.37 8.76 55 78.0 67.87 57.90 48.07 38.32 28.63 19.02 9.47 50 95.9 74.71 73.90 63.04 52.43 41.73 31.25 20.47 10.35 45 117.5 105.34 93.30 81.38 60.54 57.78 46.09 34.47 22.90 11.41 40 144.4 130.80 117.34 104.01 90.76 77.58 64.48 51.43 38.46 25.55 35 178.7 163.28 148.01 132.88 117.82 102.84 87.98 73.08 58.21 43.59 30 224.1 206.22 188.57 171.05 153.61 136.04 118.94 101.71 84.54 67.46 25 266.12 245.15 224.30 203.53 182.83 162.21 141.65 121.16 100.73 20 355.80 329.84 304.01 278.26 252.68 226.98 201.43 175.95 150.55 15 505.27 471.00 436.85 402.81 368.83 334.91 301.07 267.29 233.65 10 804.54 753.65 702.89 652.21 601.60 551.06 500.59 450.19 399.85 Door de contractie welke alcohol ondergaat wanneer deze met water vermengd wordt, verdient het aanbeveling den alcohol in apart maatglas af te meten, het water eveneens in apart maatglas en beide vloeistoffen dan eerst in flesch over te storten. Goed schudden, totdat volkomen vermenging heeft plaats gehad. Het Mikroskoop. Het eerste samengestelde, beeld omkeerende Mikroskoop werd in 1591 uitgevonden door Zacharias Janssen, brillenslijper te Middelburg. Onderverdeeling Mikroskoop: Mechanische deel 1°. Statief 2». Tubu» I met schaalverdeeling ( 160—180 mM. 3°. Revolver | voor het inschroeven van objectieven; door draaien kan het objectief verwisseld worden 4°. Objecttafel (Beweegbaar of vast). 5°. Groote instelschroef I 6°. Kleine ,, ( Micrometerschroet met schaalverdeeling; afstand tusschen t 2 streepen = 0.001 m.M. Hans Günther, Das Mikroskop und seine Nebenapparate. Stuttgart, Franckl'sche verlagbuchhandlung. Sir A. E. Wright, Principles of Microscopy. London Constable & Co. P. Harting, Het Mikroskoop. Utrecht 1848. M. Langeron, Précis de Microscopie. Paris Masson & Cie. Optische deel < „zwakke" Droogsystemen „sterke" „Nat" Systemen _ . „zwakke" Oculairen 2°. Oculairen „sterke" 3°. Condensor | met Iris Diaphragma „vlakke" spiegel 4°. Spiegel "=~- „holle" De Objectieven. 0= Focusafstand 55 m.m. J „Zwakste" ^ systeem „ maximale „ (120X) - >, •• m.m. < („Sterkste" systeem Hoe kleiner de Brandpuntsafst., hoe kleiner ook bij scherpe instelling de vrye afstand tusschen Object en Lensoppervlakte. Voorbeeld: „Zwak" Droogsysteem „Sterk" Droogsysteem „Nat': (Olie) Systeem 9 mM. 0.6 mM. 0.15 mM. „Vrije" objectafstand Idem idem „Oplossend" vermogen („afbeeldings" vermogen). Het vermogen om zeer dicht naast elkaar liggende streepen enz., zuiver gescheiden en scherp af te teekenen. Voorbeeld: Een lens welke sterk vergroot, kan slecht „oplossen" en omgekeerd. Beeld door lens met „goed" oplossend vermogen. Zelfde beeld bij gelyke vergrooting door lens met „slecht" oplossend vermogen. Het „oplossend" vermogen wordt gekeurd aan de schaalstructuur der Diatomeeen Voor „zwakke" vergrootingen = Praeparaat van Pleurosigma Angulatum „ „sterke" „ = „ Surirella Gemma Dit vermogen tot „fijne afbeelding" gaat hand in hand met de grootte der Num. Apertuur. Numerieke Apertuur (N.A. Abbe 1873). „Apertuur" = de hoek waaronder de „intreepupil" der lens gezien wordt, vanuit een punt van het voorwerp, dat op de as gelegen is, („openings" of „invals" hoek). De grootte van deze „pupil" wordt bepaald door haar randbegrenzing m.a.w.: lo. Door het „montuur" der lens. 2o. Door „blende", eventueel voor of achter het lensstelsel geplaatst (bij de objectieven is deze „blende" achter het lensstelsel geplaatst; kijk van achteren door objectief; „blende" als platte ring zichtbaar. De grootte van den „openingshoek" hangt af: Ao van den afstand van het voorwerp ten opzichte der lens. Bo van de stof welke zich tusschen lens en voorwerp bevindt. Ao Hoe dichter het voorwerp bij de lens staat, hoe grooter de „openingshoek" van den stralenkegel welke van het voorwerp uitgaat, en omgekeerd (Zie I - II)- Een Diaphragma kan bij gelyken voorwerpsafstand de invalshoek verkleinen. (Zie II-III). Waar nu het voorwerp bij het microscoop tusschen 1 en 2X den brandpuntsafstand moet staan (vergroot - omgekeerd - reëel beeld) daar spreekt het vanzelf, dat de lenzen met den kleinsten focusafstand, de grootste „Apertuur" bezitten. Dit zijn tevens de lenzen welke het meest vergrooten. Voorbeeld: „Zwakste" obj. Zeiss Focusafst. 55 m.m. „Sterkste"■ obj. Zeiss Focusafst. 1.5 m.m. . , , .Apochr. „Immersie". ,,Kleine invalshoek , „Groote" invalshoek. Begrip „Numerieke" Apertuur (N. A.) In 1873 heeft Abbe het begrip Num. Ap. in de optiek ingevoerd. Hieronder wordt verstaan: De halve „openingshoek" eener lens vermenigvuldigt met den brekingsindex (N) van de stof welke zich tusschen voorwerp en lens bevindt „(tusschenstof"). c IT II N = brekingsindex van de „tusschenstof Formule N.A.= NXSin U ,0. . IT ° x . . . , „ || (Sin) U = (Sinus) van halve „openingshoek" Deze „tusschenstof" kan zijn = Lucht brekingsindex N = 1 „ „ = Water „ N = 1.33 „ „ „ „ ~ Cederolie „ N = 1.515 Bo. Hoe meer deze „tusschenstof" den brekingsindex (N) van het lensglas nabij komt (N = 1.515) hoe meer stralen ongebroken kunnen doorgaan, m.a.w. hoe grooter de Apertuur der lens, hoe duïdelgker en helderder het beeld (zie Fig. 1, 2, 3) Voorbeeld: „Droog" systeem „Water" Immersie „Olie" Immersie De „Homog. Olie Immersie" heeft dus de grootste N.A., daardoor ook het grootste „oplossingsvermogen" en de grootste „lichtsterkte". Lichtsterkte. Hoe grooter de „openingshoek" (N.A.) eener lens hoe meer lichtstralen kunnen binnenvallen, hoe sterker de indruk die het beeld op het netvlies maken zal, des te duïdelyker wordt het gezien. Hand in hand hiermede gaan grootere helderheid en „echtheid" der kleuren. De „lichtsterkte" eener lens is evenredig aan het Quadraat der Num. Apert. Voorbeeld: Een lens met 2Xzoo groote Num. Ap. laat 4X zooveel lichtstralen door i, n 3 X »» »♦ n f >» ^ X »» »» »» „Doordringend" vermogen (diepte): Het scherp zien van de onmiddellijk boven elkaar liggende beelden. Dit vermogen is des te grooter naarmate de „Num. Ap. afneemt. Voorbeeld: / Olie \ Groote N.A. \Immersie/ = bij geringste wijziging in diepte, wordt het beeld onscherp, er moet gestadig met de micrometer schroef scherp worden ingesteld. Kleine N.A. (T) = schommelingen in „diepte" veel grooter. Het beeld krijgt daardoor „relief". Bij de mïcrophotographie is grootere „diepte" van objectief een voordeel, waar hier van den kant van het oog (samenvallen van verschillende „diepte" beelden door de accomodatie) geen sprake kan zijn. „Begrenzend" Vermogen („scherpe omtrek" van het beeld). Het scherp contoureeren van het beeld is van het grootste gewicht. Dit hangt ten nauwste samen met de correctie der sphaerische- en chromatische aberratie der lens (zie onder Achromaten en Apochromaten). Hoe grooter de Num. Ap. eener lens, hoe sterker de aberraties. Voordeelen van groote Num. Apert. Nadeelen van groote Num. Apert. Sterke „vergrooting" ; Geringe „diepte" Groote „lichtsterkte" Sterke „sphaerische" aberratie Groot „oplossend" vermogen „ „chromatische" „ De „Achromatische" objectieven. De sphaerische aberratie en hare correctie. De z.g. „afwijking wegens bolvormigheid" maakt dat de „randstralen" eener convexe lens haar brandpunt dichter bij de lens hebben dan de „centrale" stralen. Lengte der sphaerische aberratie. Er ontstaan dus een groot aantal beelden achter elkaar van verschillende irrnnttp (het «grootste" het verst gelegen 1\ grootte ^ ^ „kleinste" „ dichtst „ 3/ welke elkander niet kunnen bedekken, z.g. „verstrooiingsbeelden". De totaal-indruk van al deze „verstrooiingsbeelden" is onscherp en verwrongen. Voorbeeld: Door een lens met sph. aberratie is LETTER LE ( ) ER • Illl - (0) Hoe grooter de „invalshoek" (N.A.) hoe meer „randstralen'* binnenvallen, hoe sterker de sphaerische aberratie. De Correctie Deze heeft op drieërlei wijze plaats: lo. Door een smalle „blende" (van achteren zichtbaar in ieder objectief); de uiterste „randstralen" worden geweerd. 2o. Door „ Aplanatisch Lenzenstelsel"; divergeerende lens tegen convergeerende aan. Het brandpunt der „randstralen" wordt verlengd (geaplaneerd) de aberratie dus verkort (zie fig.). Kortere Sphaer. aber. De „richting" der „Rand"- en „Centrale" stralen, de fout blijft echter bestaan, omdat de glasmassa homogeen is (één zelfde7glassoort). Voorbeeld: __ 3o. Door het „combineeren" van glassoorten van verschillenden brekingsindex (verschillende dichtheid). De aberratie neemt af naarmate de brekingsindex van het glas hooger is. Gewoon glas N. 1.520 j Kroonglas N. 1.534 Flintglas N. 1.650 (Loodvrij glas) (Loodglas). Een convexe Kroonglas lens met een concave Flintglas lens zal, dank zij de sterkere breking van het Flintglas, de richting der stralen omkeeren. Kroon Flintglas glas Gecorrigeerde sphaerische aberratie. LETTER = LETTER Bij het „Achromatisch objectief" heeft de correctie alleen plaats voor enkele stralen, zoodat slechts een bepaalde zone van het gezichtsveld scherp kan worden ingesteld. Voorbeeld: Beeld voor een bepaald gedeelte van het gezichtsveld scherp. „ voor het overige gedeelte „ „ w onscherp. De Chromatische aberratie en hare correctie. De „afwijking wegens kleurschifting" (dispersie) is oorzaak dat het „witte" licht uiteenvalt in de „spectrale stralen", welke al naar gelang harer golflengte ieder haar bepaalde brandpunt bezitten. Lengte der chrom. aberratie. Van een voorwerp ontstaan dus evenveel gekleurde beelden als het „witte" licht in stralen uiteenvalt: het violette beeld (kleinste golflengte) het dichtst bij de lens en het kleinst „ roode „ (grootste „ ) het verst van „ „ „ „ grootst Daartusschen de overige gekleurde beelden (geel-groen), alle ongelijk van grootte. Dit oneindig aantal „verstrooiingsbeelden" zal elkander niet kunnen bedekken en geeft als totaal indruk een „wit" beeld doch met „rooden" rand (van het verst gelegen grootste beeld). Voorbeeld: Wordt het beeld opgevangen daar Groot beeld met ^ waar „roode" stralen samenvallen ' „violetten" rand (onscherp) Wordt het beeld opgevangen daar Klein beeld met "**-• waar „violette" stralen samenvallen „rood-geelen" rand (onscherp) Beide beelden hebben een ander „niveau": Rood gekleurde Bact.: I Blauw gekleurd weefsel | Door lens met Chrom. aberratie op „rood" ingesteld „blauw" onzichtbaar >p „blauw" ingesteld ,rood" onzichtbaar De Correctie: De Engelsche opticien Dolland (1757) is er in geslaagd de chrom. aberratie op te heffen, zonder dat de breking der stralen afneemt, door gebruik te maken van 2 glas-soorten van verschillend „kleurschiftend" vermogen. Brekings Index. Kleurschiftend vermogen: Kroonglas N = 1.53 0.039 Flintglas N = 1.65 0.067 Een convexe Kroonglaslens + concave Kroonglaslens leveren brandpuntsverlenging; dezelfde "chrom. aberratie blijft echter bestaan, omdat de glasmassa „homogeen" is (zelfde principe als voor Fig. pag. 32) Een convexe Kroonglaslens + concave Flintglaslens zal, dank zij de 2Xgr°°tere dispersie van het Flint, de orde der kleuren omkeeren, zoodat het tegenovergestelde beeld der chrom. aberratie ontstaat. Al naar de keuze der lens-krommingen, zijn de volgende drie mogelijkheden denkbaar: I. Brandpunt Roode stralen dichter „ Violette „ verder 1 II. Brandpunt Roode stralen verder „ Violette „ dichter III. Brandpunt Roode stralen geiyk "1 Correctje zie Fj „ Violette „ gelijk ƒ Kroon- Flintglas glas Bij het „achromatisch" objectief is de chrom. correctie alleen aangebracht voor de 2 uiterste kleuren van het spectrum (rood-violet; Primaire spectrum). De beelden van deze 2 kleuren vallen dus op precies dezelfde plaats. Voorbeeld: Beeld voor een bepaalde zone v.h. objectief scherp en zuiver van kleur (zonder randen), doch meteen lichte sluier afkomstig v.h. secundaire spectrum. Rood gekleurde Bact.: Blauw gekleurd weefsel Tegelijk zichtbaar door „achromatisch" objectief Secundaire Spectrum: Voor de stralen tusschen het „rood" en „violet" ingeiegen, n.m. „geel-groen", blijft de „dispersie" echter bestaan, deze geven het z.g. secundaire-spectrum, n.m. geel-groenen rand. De beelden door deze stralen gevormd, liggen op een ander niveau. Voorbeeld: Zie door het microscoop bij goede verlichting: om het gezichtsveld een zwak geel-groenen rand. Het geheele „beeld" krijgt daardoor een zwakke sluiering. Chromatische afwijking der Sphaerische aberratie. Ook hier hebben de „randstralen" een andere „dispersie" dan de „centrale" stralen (Abbe). Een objectief voor „centrale" stralen chromatisch gecorrigeerd, zal voor de „randstralen" wederom gekleurde randen om het beeld geven. Voor het „achromatisch" objectief is de sphaerische aberratie voor 1 kleur (n.m. voor de meest schelle kleur) over het geheele lensoppervlak gecorrigeerd, door gebruik der z.g. Jena-glazen van Schott (toevoeging van phosphor-broom en barium aan het glas) in combinatie met het Kroon- en Flint, vereenigd tot doubletten en tripletten. Meestal dienen de „frontlenzen" voor de vergrooting, de hooger op gelegen stelsels verzorgen de correctie. Summa Summarum: Ongecorrigeerd, objectief Primaire spectrum (rood, violet) Secundaire spectrum (geel-groen) Chromatische afwijking der sphaerische aberratie voor alle kleuren Achromatisch objectief Secundaire spectrum (geel-groen) Chromatische afwijking voor 1 kleur (de voornaamste) gecorrigeerd. De „Apochromatische" objectieven. De Correctie: lo. De „Apochromaten" vereenigen 3 kleuren in 1 punt (rood, blauw en geel-groen), zoowel voor de „rand-" als „centrale" stralen, zoodat het secund. spectrum tot verdwijnen wordt gebracht. Voor alle kleuren van het spectrum vallen dus hier de beelden in één en hetzelfde punt samen. 2o. De chrom. afwijking der sphaer. aberratie is hier voor 2 kleuren gecorrigeerd. Het gebruik van „Flusspat" (Fluoriet, Vloeispaat), „lichtsterk" cristal, maakt het door zijn geringe breking N = 1.4339 en geringe dispersie mogelijk combinaties te treffen met Flint- en Jenaglazen van veel hoogere „indices", waardoor hettegenovergestelde secund. spectr. wordt verkregen en dit wordt geneutraliseerd (verdwijnt). De correcties, zoowel voor „rand"- als „centrale" stralen maken dat hier de geheele lens-apertuur meer tot zijn recht komt, direct gevolg: grooter „oplossingsvermogen" en grootere „lichtsterkte". Het gebruik van sterker oculafren bij behoud van scherpte en helderheid is hier dan ook mogelijk. Voorbeeld: Zie door het microscoop bij goede verlichting = gezichtsveld zonder gekleurden rand. „Beeld" van ongekende scherpte, helderheid en kleurechtheid over het geheele gezichtsveld. De bedoeling van het Compensatie Oculair.' De „zorgvuldige" correctie der Apochromaten gaat ten koste der „vergrooting". Het aanbrengen van een niet achromatische Frontlens (halve bol) komt hieraan Apochr.' Hom. Imm. tegemoet (zie fig.); er ontstaat daardoor echter weer een chromatische fout, n.m. het „violette" beeld wordt grooter dan het roode (rand om het beeld). Door nu den „Apochromaat" over te corrigeeren (deze fout dus te verergeren, zie pag. 34) en aan het Oculair deze fout in tegengestelden zin te geven, dus „onder te corrigeeren („roode" beeld grooter dan „violette") zal deze fout „gecompenseerd" worden (verdwijnen). Voorbeeld: Kijk van achteren door Compensatie Oculair bij „doorvallend" licht (houdt het in de hand); om „blende" rooden'rand. „over" gecorrigeerde Apochromaat „onder" „ Comp. Oculair Het Compensatie Oculair is dus bij den Apochromaat noodzakelijk. De „Fluoriet" (vloeispaat) Systemen. Deze objectieven houden het midden tusschen Achromaten en Apochromaten. De lenzen zijn van „vloeispaat", de bouw is echter minder ingewikkeld, gelijkt op die der Achromaten. De „correcties" zijn iets minder zuiver dan die der Apochromaten. Van het secund. spectr. is kleine rest overgebleven. Summa Summarum: „Achromaten" (Primaire\ spectr. I Secund.Spectr. (ggre0en) Chrom. afwijking der sphaer. aberr. voor 1 kleur gecorrigeerd „Fluoriet" systemen (sec. spec.) „Apochromaten" Chrom. afwijking der sphaer. aberr. voor 2 kleuren gecorrigeerd De Oculairen. » 3 r (8 N De „Veld"lens dient: A Om het „gezichtsveld" als zoodanig te vergrooten. Zonder „veldlens" kunnen slechts enkele objectief-stralen de „oculair" lens bereiken (klein gedeelte van voorwerp tegelyk zichtbaar, zie fig.). :,Oculair" lens „Oculair" lens De „veldlens" doet alle objectief-stralen naar de , oculairlens" toe convergeeren. Het Objectief-beeld, dat juist in het brandpunt van de „oculairlens" gevormd wordt, is wel is waar kleiner geworden, doch een veel grooter deel van het beeld is nu tegel (jk zichtbaar. Door aan de „oculairlens" sterker vergrootend vermogen te geven, wordt dit gecompenseerd. Voorbeeld: Trek op Objectglas (met O.I. inkt en teekenpen) een aantal fijne streepen vlak naast elkaar. Illlllllll Als Objectief Zeiss A \ „ Oculair ,,5X(2) ƒ Schroef „oculair' en „veld" lens af. Leg „oculair" lens op Tubus Leg „veld" lens op Tubus B. Het beeld „lichtsterker" te maken door alle lichtstralen welke tot samenstelling van het beeld dienen, in de „oculair" lens te brengen. C. Het gezichtsveld „vlak" te maken. Ondanks de correctie der sphaer. aberratie van het objectief, blijft er toch nog een „rest" over (vooral bij objectieven met grootere N.A.). Deze rest geeft aan het beeld een zekere „kromming" (zie fig.) welke door de „oculairlens" nog vergroot zou worden. De „veldlens" heft deze fout zooveel mogelijk op. Voorbeeld : Trek op objectglas volgend figuurtje: Als Objectief Zeiss D \ „ Oculair „ 5X(2) ƒ schroef „oculair" lens af Bekijk het beeld met Zeis D, zonder oculair, \ dus door ledige tubus: ƒ Bekijk nu met „veldlens" in tubus: | Het Orthoscopisch (Kompianatisch) Oculair. "Ooglens" is hier een triplet. Voordeelen: vergrooting sterker, gezichtsveld grooter en vlakker. „Uittreepupil" (zie pag. 41) ligt hooger (oog behoeft minder dichtbij te worden gebracht.) Het Compensatie Oculair. Wordt alleen bij Apochromatische Objectieven gebruikt. De fout bij het Objectief door „overcorrectie ontstaan, wordt bij het Oculair door „ondercorrectie gecorrigeerd (zie pag. 36) Sphaerische- en Chromatische aberratie zijn bij de „oculairen" gecorrigeerd. De Verlichting van het Voorwerp. Microscopische Voorwerpen zijn doorschijnend, moeten met doorvallend licht worden verlicht. ^ „Vlakke" en „Holle" Spiegel Verlichtingstoestel Abbe'sche Condensor met Iris-diaphragma De Verlichtingstoestel moet: lo. Het licht in alle richtingen op het voorwerp doen vallen (parallelle-divergeerende- convergeerende stralen). 2o. Het voorwerp gelijkmatig verlichten. 3o. Het licht naar willekeur versterken of verzwakken. De Spiegel. Het licht wordt door „terugkaatsing" op het voorwerp gericht. Het voorwerp is ten opzichte der lichtbron onbeweegbaar, de spiegel moet derhalve beweegbaar zijn. De as waarom de spiegel draait is zoo berekend, dat de gereflecteerde stralen juist in het voorwerp vallen. Kunstlicht „Holle" Spiegel Divergeerende stralen („kunstlicht") convergeerend gereflecteerd „Vlakke" Spiegel Parallelle stralen („daglicht") parallel gereflecteerd Voorbeeld: Werk met Kunstlicht. Schuif condensor uit microscoop. Leg op objecttafel velletje dun kalkeer-papier. Zoek licht met „vlakken" spiegel = op papier gelijkmatig verlichte schijf. „ „ „hollen" „ — „ „ in centrum „ „ De Abbe'sche Condensor ' '' 'K ) Voor Bacteriologische doeleinden de Drie-lenzige condensor. Het licht wordt door „breking" op het voorwerp gericht. „Sterke" objectieven (sterk vergroot voorwerp) eischen zeer veel licht (spiegelverlichting alleen onvoldoende). Brandpunt van Condensor ligt in het beeldvlak (± 2 m.M. boven de maximaal omhoog-geschoven condensor, overeenkomende met de dikte van objectglas). De Condensor vergroot de hoek van inval der lichtstralen. Stralen (van spiegel afkomstig) worden door „breking" op een zeer klein gedeelte van het object geconcentreerd, dit wordt zeer hel verlicht. Num. Apert, van Condensor = 1.4 (gelijk aan Immersie systeem). Bij „gewonen" microscopischen arbeid," werkt Condensor in lucht („lucht" tusschen „boven"zijde Condensor en „onder"zijde Objectglas) N.A. hier=l. Voor zeer subtielen arbeid (Donkerveldbelichting, enz.) is het noodig de volle N.A. te gebruiken. Cederolie tusschen condensor en objectglas voert de N.A. op tot 1.4. Vermindering van licht: lo. Door sluiten van Diaphragma. 2o. Door dalen van Condensor (brandpunt wordt lager dan beeldvlak, stralen divergeeren, beeld ontvangt minder licht). Persoonlijke voorkeur aan 1. Algemeene Regelen voor Verlichting van Voorwerp. lo. Ieder voorwerp eischt zijn eigen verlichting. 2o. Voorwerpen welke door „brekingsverschillen" zichtbaar worden, behoeven weinig licht (ongekleurde objecten Hangende-druppel, Sedimenten enz.). 3o. Voorwerpen welke door „absorbtie verschillen" zichtbaar worden, behoeven veel licht (gekleurde objecten). 4o. Voorwerpen welke minder doorschijnend zijn, eischen veel licht (dikke praeparaten). 5o. Voor Bacteriologischen arbeid = Spiegel+Abbe'sche Condensor. 6o. Lichtbron op oneindig^daglicht of = spiggd kunstlicht op + 15 cM. afstand) Lichtbron vlak voor microscoop „ . . (kunstlicht) Zie voor Lichtbronnen pag. 43. Het ontstaan van het Microscopisch Beeld. Het voorwerp staat tusschen 1 en 2 X den brandp. afst. van het objectief •— Objectief geeft omgekeerd, vergroot, reëel beeld 9 juist in het brandpunt van de„oculair"lens,(ter hoogte van het „diaphragma" van het Oculair); zonder „veldlens" wordt dit beeld hooger en grooter gevormd • De „Oculairlens" werkt hier als „Loupe^ (vergroot, rechtopstaand, virtueel beeld). De „Uittreepupil": Even boven de „oculairlens" vereenigen de stralen zich (achterste brandp. v. microscoop) tot de z.g. „Uittreepupil", kleiner dan pupil van oo Op deze plaats wordt het oog gericht, de stralen vallen alle in de pupil. Het „netvlies" beeld: Deze worden door de lens van het oog binnenwaarts gebroken. Op het netvlies ontstaat omgekeerd, verkleind, reëel beeld Het „Loupe" beeld s Het oog ziet als door een „Loupe", m.a.w. het beeld schijnt voor het oog sterk-vergroot en dit wordt nu omgekeerd terug geprojecteerd tot het sterk vergroote, rechtopstaande, virtueele beeld op 250 mM. afstand (afstand van duidelijkst zien van het oog). Voor dezen normalen oogafstand zijn alle vergrootingen berekend. Bij anderen oogafstand wijzigen de vergrootingen zich. De voorgeschreven Tubuslengte (zie pag. 42) bepaalt mede dezen „oogafstand." Voorbeeld: (Objectief-beeld). Trek op objectglas volgend figuurtje (zie fig.) Objectief Zeiss A ï Ste' dit fi«!uurtie scherP in i l moet binnen gezichtsveld Oculair „5X(2)ƒ b,.jven Schroef van oculair beide lenzen af. Leg op „diaphragma" van oculair schijfje dun kalkeer-papier. Schuif de „lenslooze" huls in tubus tot het beeld zich scherp vertoont (oog hooger plaatsen vanwege den afstand van „duidelijkst zien". I slechts gedeelte van | voorwerp zichtbaar Voorbeeld: („veldlens" beeld). Schroef „veldlens" aan 1 Beeld wordt kleiner ƒ doch is nu geheel zichtbaar Voorbeeld: („Oculairlens" beeld). Voeg „oculairlens" toe. r\ 1 Beeld zooveel malen grooter \ ƒ als „oculairlens" aangeeft Voorbeeld: („Uittreepupil") Neem schijfje kalkeer-papier uit Oculair en breng Oculair in Tubus. Houdt boven Oculair stukje dun kalkeer-papier. Op bepaalde hoogte kleinlichtend-scherp omlijnd kringetje. Dit „kringetje" is kleiner en dichter bij de lens gelegen, naarmate het „Oculair" sterker is. (Probeer dit met verschillende Oculairen.) De Tubus-lengte. De lenzen van het microscoop zijn onderling zoo gecentreerd, dat chromatische en sphaerische aberratie zoo zuiver mogelijk gecorrigeerd zijn, met behoud der N.A. en het vergrootend vermogen van het betreffende lenzenstelsel. Dit alleen mogelijk bij een bepaalden afstand tusschen objectief en oculair» m.a.w. bij een bepaalde tubuslengte (afstand tusschen bovenrand tubus en schroefvlakte objectief). Tubus-lengte bij verschillende microscopen anders (zie pag. 54, hierop streng te letten). Wordt tusschen Objectief en Tubus „revolver" ingelascht, zoo moet dikte hiervan van tubuslengte worden afgetrokken (zie pag. 54). Dikte Dekglas: Bij „droogsystemen" tusschen objectief en voorwerp „lucht" (heterogene tusschenstof, zie pag. 30). Verloop van straal door „dun" dekglas 4- lucht is anders dan door „dik" dekglas-}-lucht, zie fig. „Dik" Dekglas Praeparaat Objectief „Dun" Dekglas De „aberraties" zijn nu voor een bepaalde dekglas-dikte (0.15—0.20 mM.) gecorrigeerd geworden. Voor „zwakke" droogsystemen eenige schommeling toegestaan, gewone dekglazen voldoende. Voor „sterke" droogsystemen (groote N.A.) en „Water Immersie" juiste dekglasdikte van groot belang (meestal op objectief gegraveerd). Zeiss .... 0.17 mM. | ^gpj^gi-jsehé aberratie treedt Leitz 0.16 0.18 „ { bJ. gebruik van andere Reichert . . . 0.18 „ dikten» Winkel. . . . 0.17 „ J „Correctie-ring" aan objectief maakt gebruik van andere dekglasdikten mogelijk, (door draaien worden lenzen tenopzichte van elkaar verschoven (zie bij „Donkerveldbelichting"). Voor „Homog. Olie Immersie" wordt „dekglasdikte" verwaarloosd. Cederolie maakt hier de „tusschenstof" homogeen. Zie voor bepaling „dekglas-dikte" onder „Donkerveld-belichting". Eenige algemeene Wenken. Lichtbronnen. Daglicht: Plaats microscoop nooit in de zon, (het Noorden is het beste). Het gunstigste licht is dat der ivitte wolken. Plaats microscoop + d 1 M. van het raam. Kunstlicht: De microscopiseer-lamp moet vast staan. Geen „pendellamp". Electrisch Licht: Monteer 50 kaars, half mat (V2 watt) Philips-Lamp in deksel van eenvoudige blikken bus (laagbreed model, zie fig.) In deksel gaten voor uitstraling warmte; zoo noodig kan men hiervoor bus van binnen nog omringen met asbest-papier. In bus-wand opening van + 3 cM. diameter, voor het doorlaten van den lichtkegel. Zeer fraai wit licht geeft de 100 kaars Zonlicht-Lamp van Philips (blauw-glas), op zelfde wijze te monteeren. Oas-licht : Gloeikousje, liefst lilliput-model omgekeerd. Plaats hiervoor scherm van asbest waarin opening van + 1 d 2 cM. diameter, zoo, dat de lichtkegel juist op den spiegel valt. De Cederolie. Dikke aetherische olie, door destillatie verkregen uit zaagsel van Junipera Virginania (Virginische Ceder); oorspronkelijk is deze olie „dun", men laat deze „indikken" tot den gewenschten brekingsindex is bereikt. Cederolie is oplosbaar in Xylol, Benzine en Alcohol. Glasstaaf N 1.520 Lucht N = 1 Glasstaaf „zichtbaar" 31asstaaf N —1.520 Cederolie N = 1.515 Glasstaaf ,onzichtbaar" Gebruik alleen zeer zuivere cederolie van juisten brekingsindex N = 1.515. Meest aan te bevelen deze olie te betrekken van firma waar microscoop vandaan is; hier is de brekingsindex juist die van het betreffende lensglas. Door lang staan dikt de olie in (oxydatie aan de lucht). Nooit op goed geluk deze met Xylol of Benzine verdunnen (index verandert). Bijgaand Cederolie-fleschje is het meest aan te bevelen („indikken" en „aankoeken" hier minder dan in fleschje met deksel). Cederolie welke in voorraad wordt gehouden, bewaren in flesch hermetisch afgesloten. (Caoutchouckurk of gewone kurk dicht gelakt). Zie voor verwijdering Cederolie pag. 47. Het „beetpakken" van het Microscoop. Het is dikwijls een gewoonte microscopen als I aan te vatten om den micrometer-schroef j Dit is fout\ de zwaarte van het Instru¬ ment hangt dan aan deze schroef; deze wordt omhoog gedrukt, spiraalen schroefdraad kunnen daardoor worden verstoord. Al is het minder gemakkelijk, dergelijke Instrumenten moeten aan den voet worden aangevat. Bij microscopen voorzien van duidelijk handvat (//) wijst de weg zich van zelf. Het „opbergen" van het Microscoop. Na „sporadisch" gebruik Berg het microscoop in zijn kast. Blijven de lenzen aan het Instrument, zorg dan dat tuhus aan beide zijden door lens is afgesloten (Objectief en Oculair). Nooit objectief alleen; door open tubus valt alle stof op het objectief. Bij langdurige opberging doe men de lenzen (na reiniging) in de betreffende hulzen. Laat echter steeds een oculair in tubus (anders valt er teveel stof in tubus). Na „veelvuldig" gebruik. Bij dagelijksch-veelvuldig gebruik is het telkens opbergen in kast bezwaarlijk. Laat het Instrument op tafel staan, beschut het echter voor stof en licht: lo. Plaats het Instrument daartoe op stuk vilt (stofvrondefrtant.ng aa") 20. Bedek „ „ door glazen stolp ('vërn'iT^wa^fgemaakT) De Stolp moet rondom op het vilt rusten. Minder kostbaar is bedekking door cartonnen koker (zelf te maken). Het „onderhoud" van het Microscoop. A. Men beschutte het microscoop tegen chemische invloeden (zure dampen enz. enz.) In dergelijke ruimte nooit microscopiseeren. B. Zij die last hebben dat, gedurende het microscopiseeren de waterdamp der uitademingslucht tegen het koper condenseert, voorzien tubus van z.g. ademscherm (in den handel verkrijgbaar). C. Komt het Instrument bij het microscopiseeren met vloeistoffen in aanraking (water, kleurstof, bloed, serum, enz.) zoo worden deze verwijderd dadelijk na afloop der bewerking. Reiniging en onderhoud „Mechanische" Deel. Koperen- en Gelakte deelen Doffe vlekken op Objecttafel (afkomstig van Benzine enz.) Stof Het „smeren" der Tandrad-bewegingen Groote instelschroef, micrometerschroef en condensor (indien deze beweegbaar is) Reiniging „Optische" Deel. Lenzen, Condensor, Spiegel. Mechanische reiniging van Optiek: Oculairen worden uit elkaar geschroefd Objectieven worden intact gelaten Wrijf met zeemlederen lap af. Nooit met alcohol, daar anders de Koper- en Lakvernis oplost. Zoo noodig met een weinig Benzine. Wrijf gewone Olie goed in; tafel wordt wederom zwart glanzend. Wordt weggeblazen of met penseel uit hoeken en gaten verwijderd Alleen gebruik van Horlogemakers olie (zuur-vrije olie). Het smeren is af en toe noodig en moet met veer of penseel voorzichtig gebeuren. Reiniging lenzen geschiede voor alles voorzichtig; druk op de frontlenzen kan deze verschuiven en zoodoende de juiste centratie verbreken. Oculair-lens en Veld-lens (zie pag. 37) Geen lenzen afschroeven; deze zijn stofvry ingesloten. Hier wordt dus alleen voor- en achterlens gereinigd. Houdt objectief daarbij in de hand. Bij „zwakke" systemen kan het „lenslooze" achterdeel worden afgeschroefd. Raak nooit aan de frontlenzen (d.w.z. niet afschroeven of drukken). CondensorAenztn niet afschroefbaar Het „stof-vrij" maken Spiegel Hier alleen reiniging van voor- en achterlens. Blaas lenzen af en strijk deze met zacht penseel na. Zoo noodig op lens ademen, en met zacht linnen lapje voorzichtig afwrijven. Reiniging achterlens objectief wordt gecontroleerd door telkens van achteren door objectief heen te zien, naar het licht toe. Wrijf af met zeemlederen lap, zoo noodig met alcohol. Chemische reiniging van Optiek: Lenzen, Condensor. Alleen noodig wanneer mechanische reiniging niet voldoende blijkt. De keuze der reagentia wordt bepaald door de stof waarmede de lenzen aan elkaar gekit zyn, (volkomen doorzichtig en van zelfden brekingsindex als lensglas). Het reagens mag deze kit-substantfe niet aantasten (oplossen); de lenzen zouden anders ten opzichte van elkaar kunnen verschuiven. Als Kit-substantie wordt gebruikt = 1°. Canadabalsam ( BenzineberTxylol ) „ =2». Schellak ( 0p^j£aha£i'n ) Soms combinaties hiervan, tenslotte is dit fabrleks-geheim. Iedere microscoop-fabriek geeft het reagens op, dat de Kit-substantie der betreffende lenzen niet schaadt, doch waarin cederolie oplosbaar moet zijn, teneinde deze van de lens te kunnen verwijderen. Voor Zeiss-Leitz en Winkel = Xylol of Benzine. ,, Reichert = Alcohol 96 %. De Cederolie wordt op deze wijze ook van Immersie-lens en zoo noodig van Objecttafel verwijderd. Zie voor Techniek der Chemische lens-reiniging pag. 55. Of vlekken op de frontlenzen aanwezig zijn en reiniging ervan is geslaagd, controleere men door lens met loupe te bezien (als loupe kan dienen oculairlens van Oculair). Blijven de lenzen dof en vlekkerig na al deze bewerkingen, zoo worden zij naar de fabriek opgezonden ivooral zelf daaraan niet verder prutsen). Waar komen „vuiltjes" in het gezichtsveld vandaan? Zijn in het gezichtsveld vuiltjes aanwezig, zoo ga men ter opsporing als volgt te werk: 1°. Verschuif het Praeparaat terwijl men door het microscoop ziet 2°. Draai aan Oculair terwijl men door het microscoop ziet Verplaatsen de „vuiltjes" zich niet zoo heeft het praeparaat (objectglas enz.) geen schuld. Draaien „vuiltjes" mede, zoo is het oculair vuil, zoo niet, ligt de fout in het objectief. Het gezichtsveld behoort egaal wit te zien; controleer dit eerst voordat praeparaat er onder ligt. De „Mouches-Volantes". Lichaampjes welke in het glas-vocht van het oog zweven en zich in het gezichtsveld van het microscoop vertoonen als kleurlooze- rondekringetjes, soms parel-snoerachtige filamenten en strengen, welke een eigenaardige drijvende beweging vertoonen. Dat zij niet bij het praeparaat behooren, kan men nagaan door het praeparaat te bewegen-, de „mouches" zullen zich aan deze beweging niet storen. Subjectief kunnen deze „vliegende-muggen" bij het microscopiseeren hinderlijk zijn; door oefening leert men deze echter niet meer zien. Vermoeienis heeft verergering dezer „lichaampjes" tengevolge; bij langdurig microscopiseeren doet men goed, telkens korte rustpoozen in te lasschen. Keuring der Lenzen voor ae rraiaijK. Voor „afbeeldingsvermogen" en „vlak zijn" gezichtsveld (zie pag. 29—38) Voor Immersie-lens. „Hangende-druppel" praeparaat van B. Typhus, Coli, Proteus enz. Voor „sterke" Droogsystemen. Zeiss D—F enz. „Hangende-druppel" praeparaat van miltvuur-bacillen (groote bacteriën) Voor „zwakke" Droogsystemen. II Zeiss A Gelatine-plaat Colonie van Coli en Cholera Bacterien moeten scherp gecontoureerd en duidelijk zichtbaar zijn; groot gedeelte van gezichtsveld tegelijk scherp instelbaar. Duidelijk scherp gecontoureerde kettingen van bacteriën, waarin sporen als lichtende ovalen zichtbaar. Verder korrels van Chromatine in cel scherp afgeteekend. Zuiver gecoutoureerde Colonie met scherp afgeteekende inwen dige structuur. Voor „Correctie der aberraties" „lichtsterkte" en „kleur-echtheid" (zie pag. 30 tot 35) Voor Immersie-lens. 1°. Sputum-praeparaat volgens Ziehl-Neelsen gekleurd. 2°. fi/öerf-praeparaat volgens Oiemsa gekleurd Voor „sterke" Droogsystemen Zeiss D—F enz. 1°. Bloed-praeparaat volgens Oiemsa gekleurd. 2°. Sporen-kleuring van miltvuurbacillen Voor „zwakke" Droogsystemen Zeiss A enz. Contrastrijk gekleurde Pathol. Anatom. Praeparaten Diverse kleuren tegelijk zichtbaar, „echt" van kleur en lichtsterk. Korrelingen scherp afgeteekend en duidelijk zichtbaar. Idem. Idem. Kleuren tegelijk zichtbaar, „echt" en helder. Weefsel- en cel-structuren scherp gecontoureerd en afgeteekend. Vergrootingstabel ZEISS Objectieven en Oculairen. Achromatische Objeclieven Num. Brand. Apert. Afst. m M. 0.20 18.- 0.40 8.3 0.65 4.4 0.90 2.9 0.90 2.- 1.18 2.- 1.25 2.- „Droog" systemen Oude Nieuwe naam naam 8 C 20 _1) 40 Fluoriet system. r E 60 L F 90 „Nat" systemen Water , gg Imm. J "oTe' V,2" 90 Iinm. Apochromatische Objectieven Num. Brand. Droog<. systemen Apert. Afst. mM. Naam 0.30 16.2 10 0.65 8.3 20 0.95 4.3 40 0.95 2.9 60 „Nat" systemen 1-25 2.5 „Versie 70 i a o Hom* 0,ie QO lA Immersie Huygens'sche Oculairen. Kompensatie Oculairen. 1 j 2 | 3 4 5 Oude naam 2 4 6 8 12 18 4X 5X 7X 10X 15X N- naam 3X I 5X 1 7X IPX 15X 20X 32 40 56 80 120 80 100 140 200 300 160 200 280 400 600 240 300 420 600 900 180 300 420 600 900 1200 360 450 630 900 1350 270 450 630 900 1350 1800 360 450 630 900 1350 270 450 630 900 1350 1800 360 450 630 900 1350 270 450 630 900 1350 1800 30 50 70 100 150 200 60 100 140 200 300 400 120 200 280 j 400 600 800 180 300 420 600 900 1200 2101 350 490 700 1050 1400 270 ! 450 j 630 j 900 | 1350 | 1800 Kompensatie oculairen alleen te gebruiken bij Apochromaten; bij Achromaten alleen met Num. Apert, boven 0.65. De becyfering (naam) van Objectieven en Oculairen beteekent de „eigen" vergrooting van het systeem. ,. . . ,. ( ^ Bij 160 mM. Eigen vergrooting objectief Totale l Tubuslengte X .. , . vergrooting f 250 mM. beeldEigen vergrooting oculair 6 & J afstand De onderstreepte objectieven en oculairen zijn de meest gewilde combinaties. Generaal Agent voor Nederland van Firma Carl Zeiss te Jena — Firma Marius te Utrecht. Vergrootingstabel LEITZ Objectieven en Oculairen. Achromatische Objectieven | „Droog" systemen I Num. Brand. Eigen Apert. Afst. vergr. mM. 0.30 16.2 10.3 0.47 10.- 8.2 0.82 4.- 48.- 0.85 3.- 62.5 0.87 2.6 69.1 0.87 2.2 85.2 Naam _3_ 4 6 7 Fluoriet system. (1 „Nat" systemen 1.20 2.1 90.6 Versie} 10 1.30 1.8 105.- oije°im'm.(lll2 Apochromatische Objectieven „Droog" systemen Num. Brand. Eigen Naam Apert. Afst. vergr. mM. mM. 0.30 16.- j 11.5 >6 0.65 8.- 23.0 8 0.95 4.- 46.0 4 0.95 3.- 66.0 3 „Nat" systemen 1 40 2 - 92 - Hom. I o 1.4U z. |OUeImm , i Huygens'sche Oculairen. Kompensatie Oculairen. 4X 5X 6X 8x j 10X| 12X vergrooting 2.8X j 5.6X |'8.3X [ll.lxjl6.7x 25.0X 0 I II 1 111 I IV I V Naam 2 4 6 8 12 18 41 51 62 82 103 123 29 58 85 114 172 258 73 91 109 146 182 218 51 102 151 202 304 455 192 240 288 384 480 576 134 269 398 533 802 1200 250 312 375 500 625 750 175 350 519 694 1044 1563 276 346 415 553 691 830 193 387 574 767 1154 1728 341 426 511 682 852 1022 239 477 707 946 1423 2130 362 453 543 724 906 1087 254 507 752 1006 1513 2265 420 525 630 840 1050 1260 294 588 872 1165 1754 2625! I - 45 57 70 90 115 140 32 64 95 128 192 287 90 115 140 180 230 280 64 129 191 255 384 575 180 230 280 360 460 560 129 258 382 511 768 1150 270 330 410 540 660 820 185 370 548 733 1102 1650 360 460 560 720 920 1120 258 515 764 1021 1536 2300 Kompensatie oculairen moeten bij Apochromaten —kunnen echter ook bij Achromaten worden gebezigd. . . t 1 Bij 170 mM. Eigen vergrooting objectief Totale I Tubuslengte = X - vergrooting \ 250 mM. beeld- Eigen vergrooting oculair s 6 ) afstand Onderstreepte objectieven en oculairen zijn de meest gewilde combinaties. Generaal Agent voor Nederland van Firma Ernst Leitz te Wetzlar — D. B. Kagenaar te Utrecht. Vergrootingstabel REICHERT Objectieven en Oculairen. Achromatische Objectieven Huygens'sche Oculairen. (Compensatie Oculairen. Num B,„a. »x "X|5.5X 7X ,x 9SBT «x|«x *x|»x|BX »X I Naam AP-rl- Af"« ver«r I H III IV V Naam 2 4 6 8 12 18 mM. [ = = = 0.30 18.5 15.7 _3_ 50 60 75 95 130 0.45 8.- 25- 4 70 90 110 145 200 240 0.85 4.3 78.5 6 180 230 280 375 520 640 0.85 3.2 94.- 7a 260 335 400 540 750 900 0.90 2.- 141.- 9 385 495 585 800 1100 1400 „Nat" systemen 1.15 1.8 137.- In?^ersre 1 10 440 560 720 900 1280 1650 1.30 1.8 158.- oiielm'm.i470 600 725 980 1350 1800 Apochromatische Objectieven „Droog" systemen Num. Brand. Eigen .. Naam Apert. Afst. vergr. mM. 0.30 16.- 15.5 2/3 31 62 93 124 186 279 0.60 8.- 31.- '/3 62 124 186 248 372 558 0.95 4.- 63.- >/• 125 250 375 500 750 1125 0.95 3.- 85.- '/9 170 340 510 680 1020 1530 „Nat" systemen 1.4 2.- 125.- oiie°iram.) '/i2 ! 250 500 750 1000 1500 2250 Kompensatie oculairen moeten bij Apochromaten — kunnen echter bij Achromaten met Num. Apert, boven 0.65 worden gebezigd. Bij 160 mM. Eigen vergrooting objectief Totale ( Tubuslengte = X vergrooting 250 mM. beeldEigen vergrooting oculair ° J afstand Onderstreepte objectieven en oculairen zijn de meest gewilde combinaties. Generaal-Agent voor Nederland van Optische-werke Reichert te Weenen = Dr. L. Minarik, Amsterdam. Vergrootingstabel WINKEL Objectieven en Oculairen. Achromatische Objectieven Huygens'sche Oculairen Kompensatie Oculairen. Eigen ver- i „Droog" systemen 3>< 4x 6x 8x 12x g6rooting 3.5x 4 3X 5.3x 6.7X 8.3X12.3X17X Num. Brand. Eigen Naam i Apert. Af«t. verjr. 1 2 3 4 5 Naam J 2 3 4 I 5 6 7 mM. — 0.28 16.- 13.5 2 47 61 71 125 177 47 59 73 90 107 175 255 0.35 12.2 20.- 3 60 79 116 154 232 60 78 98 122 144 238 340 0.60 5.5 454 JL '45 190 280 380 550 142 180 225 280 325 535 770 0.85 3.5 67.6 6 200 265 390 540 760 200 250 310 390 460 750 1170 0.90 3.- 83.- 1± 255 340 490 680 1000 250 310 395 495 575 940 1400 „Nat" systemen ~ 1.15 2.- 125.- Water-Imm. 362 480 710 970 1380 360 460 585 730 870 1400 2130 1.30 1.8- 132.- 01ie°Im'm. 425 550 820 1125 1620 410 515 660 810 960 1550 2300 = ; ; — Apochromatische Objectieven „Droog" systemen Num. Brand. Eigen Naam Apert. Afst. vergr. mM. mM. 40.- 6.4 40 14 18 23 28 33 53 76 0.20 24- 10.6 24 24 32 39 48 57 95 137 0 36 14.- 18.5 14 52 65 82 102 118 198 295 065 7 35. 7 104 132 165 209 243 404 590 095 4. 625 4 189 235 290 365 415 690 1030 0 95 3- 80^5 3 247 308 385 480, 575 925 1400 „Nat" systemen ————— ——— ——j 0 Hom. i „ ! 361 456 575 740 860 1440 2100 ï.jb z.- ïzu.- 01ie Imm.j ^ I | Kompensatie oculairen moeten bij Apochrom. — kunnen echter ook bij Achromaten worden gebezigd. 170mM. Tubuslengte = Vergrootingen berekend b.j: beeldafstand Onderstreepte objectieven en oculairen zijn de meest gewilde combinaties. Generaal-Agent voor Nederland van R. Winkel te Göttingen ~ Firma Marius te Utrecht. Het eenvoudige microscopische Uitstrijkpraeparaat. a. 24 uur oude cultuur (liefst van agar-agar); enz. enz. b. Objectglazen (bewaren in steenen zeep-bakje met deksel)* C. Platina oogje. d. Duinwater of Physiologische zoutsolutie (0.85% NaCI in water). Utensiliën: €. Glaspotlood. f. Filtreerpapier. g. Lapje. h. Kleurstof, (in fleschje met trechtertje, waarin filtertje van filtreerpapier). U Kleurbakje (smal tandenborstel-bakje). Techniek der Methode: 1°. Maak objectglas stofvrij (afwrijven met lap) en vetvrij (enkele malen door de vlam halen), en leg het boven op het kleurbakje. 2°. Leg door middel van uitgegloeid oogje, druppel schoon water of zoutsolutie, midden op de ontvette zijde van het afgekoelde objectglas. Vloeit druppel ineens uit, zoo is het glas te warm; is de druppel moeilijk uit te wrijven, zoo is het glas nog vet. 3°. Breng door middel van uitgegloeid oogje een weinig van de cultuur in het druppeltje, en wrijf gelijkmatig in de rondte uit. (Oppervlak kwartje). Mocht er teveel bacteriën-materiaal aan het oogje zijn, dan late men er eerst een vlokje van in het druppeltje vloeien; gloei het overige in de vlam uit, laat oogje even afkoelen, en wrijf daarna den druppel gelijkmatig in de rondte uit. 4°. Desinfecteer oogje door uitgloeien (rood gloeiend). 5°. Laat praeparaat aan de lucht goed drogen of boven de Bunsen'sche vlam. 6°. Omgeef het object door 2 dikke glaspotlood-streepen, om het afloopen der kleurstof tegen te gaan, en de praeparaat-zijde te onthouden. Plaats vooral ook naast of boven ieder praeparaat den naam van het organisme. 7°. Fixeer nu het goed droge praeparaat, door het enkele malen snel, met de praeparaatzijde naar boven, door de vlam te halen, (coaguiatie van de eiwitten). 8°. Giet de gefiltreerde kleurstof op het praeparaat en laat die inwerken. (Carbolgent: Violet 2 min.; óf Loeffler'sch Methyl: Blauw 2 min.; óf Waterige Fuchsine 3-5 min. naar verkiezing). 9°. Qiet eerst de overtollige kleurstof in het kleurbakje af en spoel het praeparaat onder den waterstraal. 10°. Droog praeparaat tusschen filtreerpapier en vervolgens nog boven de vlam. Het microscopisch onderzoek van het gekleurde Praeparaat. Maximale lichtsterkte. Het is noodzakelijk bij het microscopiseeren in het algemeen, beide oogen geopend te houden, het niet microscopiseerende oog op oneindig in te stellen, dus niet te laten accomodeeren. Om zich hierin te oefenen, doe men het volgende: Neem een stuk wit papier en houdt dit, terwijl er gemicroscopiseerd wordt, horizontaal tegen de tubus aan, dicht bij het niet microscopiseerende oog. Het oog krijgt daardoor een doelwit om naar te zien, en kan gemakkelijk geopend blijven. Van lieverlede late men het papier zakken, totdat het oog gemakkelijk zonder dit doelwit geopend en op oneindig ingesteld kan blijven. Optische samenstelling: Om bacteriën duidelijk te kunnen zien, werke men met z.g. „nat systemen" (Immersie-lenzen), die in combinatie met oculairen de gewenschte vergrootingen geven: Voor Zeiss als objectief de Homog. Olie Immersie 00 O/12) als oculair 10X(4) ,, Leitz ,, „ ,, i, „ jj 112 » » 4 „ Reichert „ „ „ » „ » 1' 12 » » 4 „ Winkel „ „ „ „ „ » 1.8 mM. „ „ 4 Vergrooting +900 maal. Cederolie Brekingsindex N 1.515 Lensglas „ N = 1.515 Homogeen Objectglas 1 N 1 520 systeem Dekglas ƒ " Stel het microscoop op de volgende wijze: a. Vlakke spiegel naar boven, (evenwijdige stralen). b. Irisblende geheel geopend. c. Abbe'sche Condensor geheel omhoog geschoven, totdat deze stuit, (het brandpunt ligt dan voor evenwijdige stralen in het object, zie pag. 40) d. Trek tubus uit: Voor Zeiss zonder revolver tot 160 m.M. „ „ met „ „ 145 „ „ Leitz zonder „ „ 170 „ „ „ met „ ,, 152 „ „ Reichert zonder „ „ 160 „ ,, „ met „ ,, 145 „ „ Winkel zonder „ „ 170 „ „ „ met „ „ 155 „ Techniek der instelling: 1°. Leg midden op het object een druppel ceder-olie (dezelfde brekingsindex als glas). 2°. Leg praeparaat op objecttafel, en draai nu door middel van de groote instelschroef (rechterhand), het oog steeds van ter zijde (langs tubus) gericht op het praeparaat, de Immersielens naar omlaag totdat deze contact met den cederolie-druppel heeft. 3°. Draai nu nog even terug (naar omhoog), totdat er nog net even contact met de cederolie bestaat, (het lijdt dan geen twijfel of ge zijt boven het praeparaat niveau). 4°. Kyk door oculair en zoek nu, door middel van den vlakken spiegel, naar de maximale lichtsterkte. 5°. Draai nu, steeds door het oculair ziende, met de groote instelschroef het objectief voorzichtig naar omlaag, totdat het object in 't zicht komt (wazig gekleurde massa). 6°. Stel nu het object fijn en scherp in, door middel van de kleine instelschroef (micrometerschroef). Het reinigen van Objectieven en Oculairen. v i « r r» • ) voor Zeiss, Leitz a. Xylol of Benzine j en wini Cederolie (Immersie-olie). d. Etiketten. Het reinigen: 1°. Ontdoe het praeparaat van de Cederolie door het voorzichtig met een watje, waaraan wat xylol of benzine, af te deppen. Ook kan men het in een wijdmondsch fleschje, waarin een van deze beide vloeistoffen, afspoelen. 2°. Laat praeparaat daarna drogen, totdat alles is verdampt (gaat spoedig). 3°. Plak er een etiket op, waarop naam van het organisme, kleurmethode en datum staan. De op deze wyze gereinigde praeparaten kunnen buiten invloed van LICHT en STOF, lang bewaard worden. Het insluiten : Wil men ten overvloede toch nog het praeparaat insluiten (met een dekglas bedekken), zoo neemt men als insluitmiddel oliën die niet reduceerend werken (niet de kleurstof uittrekken = Immersie-olie, Paraffine-olie). 1°. Reinig eerst het praeparaat van de Cederolie. 2°. Laat er een versche druppel cederolie (Immersieolie) op vallen, en bedek het door een goed gereinigd (zie pag. 61) dekglas. Gewone Canadabalsam is niet aan te bevelen, daar deze meestal zuur reageert en daardoor de kleurstof wordt uitgetrokken; vooral nooit voor bloedpraeparaten gebruiken. Neutrale Canadabalsam (bij Firma Dr. Grübler Leipzig, in tuben) is meer aan te bevelen. Men kan het dekgals nog omranden met gesmolten mengsel: Colophonium 8 deelen en Was 2 deelen. Het Gram-Praeparaat. Utensiliën* Dezelfde als voor het ,.eenvoudige uitstrijkpraeparaat" (zie pag. 53). Kleurstoffen: a. Carbol Gentiana Violet. Sol. sat. Gentiana Violet in alcohol 96 % . 10 Sol. aquos. acid. Phenyl. Cristallis 1 % . 90 t . . . , . Jodii ^ J.-hJ- K. eerst oplossen in 1 b. Lugolsche oploss.ng. ^ 5 ccm Aqua Desi> vervol_ 2 In bruine flesch bewaren. Aquae Dest.j gens de 295 ccm. toevoegen 300 C. Alcohol 96 0/o Sol. sat. Fuchsini in alcohol 96 % . 10 d. Waterige Fuchsine. Aquae Dest 90 Techniek der kleuring: De Gram'sche kleuring moet op de seconde af geschieden, dus met het horloge» 1°. Maak dun gelijkmatig uitstrijkpraeparaat en fixeer dat op de gewone wijze (zie pag. 53). 2°. Kleur met Carbol Gentiana Violet 3 min. 3°. Giet overtollige kleurstof af, niet spoelen. 4°. lood joodkalium (Lugol) opgieten en laten inwerken . . .2. m;n. 5°. Jood joodkalium afgieten, niet spoelen. 6°. Flink spoelen in alcohol 96 % 1 m'n- Telkens flink Men houdt zich steeds aan „dezelfde" heen en weer Gram-methode bewegen. 7°. Flink afspoelen onder den waterstraal. 8°. Laat het praeparaat afdruipen op filtreerpapier, (vertikaal) totdat het meeste water is opgezogen. 9°. Nakieuren met waterige Fuchsine 3 min. 10°. Afspoelen onder den waterstraal. 11°. Drogen tussehen filtreerpapier en verder boven de vlam. Voor degenen wier oogen weinig gevoelig zijn voor het kleurcontrast paarsrood, wordt aanbevolen inplaats der Fuchsine BïsmarckbruinrrVesuvine te gebruiken. I Vesuvine (Bismarckbruin) 3 i I Alcohol 96 % 30 | | Aquae Dest. 70 | Theorie der Gram'sche kleuring. Het Jood-joodkalium gaat met het Qentianaviolet een verbinding aan, Joodgentiaanverbinding (donker violetzwarte kleur), welke door sommige z.g. Grampositieve cellen tegenover alcohol 96 % wordt vastgehouden, door andere z.g. Gramnegatieve cellen in den alcohol wordt losgelaten (zie pag. 16 en 20). Het Gram + (positieve, vaste) organisme is dus donker violet gekleurd, (de Joodgentiaankleur wordt behouden). Het Gram (negatieve, losse) organisme is dus rood gekleurd, (de Joodgentiaankleur wordt in den alcohol losgelaten en de nakleurstof, het Fuchsine aangenomen). De „Massa" Gram-kleuring 0 Volgens M. van Riemsdijk. a. Glasraam 2) voor het tegelyk inschuiven van verscheidene praeparaten. De langszyden van het raam bestaan uit 3 glas-reepen: 2 van dubbelglas en 1.5 cM. breed (de buitenste) 2 „ dunner „ „ 1.2 cM. breed (de middelste) Deze 3 reepen worden door Natron-waterglas op elkaar gekit (eenvoudig bestrijken en laten drogen). 1) M. van Riemsdijk. Een „massa" Gramkleuring. Tijdschr. v. Vergelijkende Geneeskunde Deel X afl. 2-3. 2) Verkrijgbaar bij Firma Marius te Utrecht. Door de middelste reep ontstaat de gleuf. Men zorge er voor de gleuf zoo te maken, dat de praeparaten er gemakkelijk inschuiven, doch niet over elkaar kunnen schuiven. Om te maken dat de objectglazen er bij B niet uit kunnen glijden, wordt onder B de gleuf opgevuld door een reepje glas, zoo breed als B, met waterglas in de gleuf bevestigd, zie figuur. b. 4 Kleur Receptacula. Vierkante praeparaatglazen * a .... . 1 voor Gentiana Violet A voor Anatomische-praeparaten, met platgeslepen rand en 00R ^ " 1 „ Aqua Communis B daarop passend deksel, Franz RangH c ° m 1 » Lugol'sche oploss. C Hugershoff No. 405 Liste I rect c , Waterige Fuchsine D Allgem. Chem. Apparate )Hoog 45 cM. Lang 13 cM. voor Alcohol 96 % E Breed 12 cM. C. Filtreerpapier. d. Gele vaseline. e. Zwart papier (vellen). ƒ. Alles wat voor het „eenvoudige Uitstrijkpraeparaat" noodig is (zie pag. 53). Kleurstoffen en Reagentia. Dezelfde als voor de „Gram-kleuring" (zie pag. 56) Techniek der Methode. De Gram'sche kleuring moet op de „seconde" af geschieden, dus met den „seconden-wijzer", hier nog beter een „stop-watch". 1°. Omplak de flesschen voor Oent. Violet, Lugol en Fuchsine (A-C-D) met zwart-papier. Voorzie deze ook van los, overhangend deksel van zwart-papier (om het licht te weren, waaraan deze groote oppervlakten bloot staan; beïnvloeding der reagentia). 2°. Bestrijk de platte flesch-randen met vaseline, opdat deksel hermetisch aansluit (om verdamping der vloeistoffen tegen te gaan). 3°. Plaats flesschen A-B-C achter-elkaar, flesch E en D er naast, en vul deze met de betreffende vloeistoffen (zie onder b). De kleuring: („op de seconde") 4°. In Carbol-Gentiana Violet 6 min. 5°. In Aqua Comm 20 sec. Toestel telkens geheel er in en geheel er uit + 9X- 6°. Vertikaal uitdruipen op fil- treerpapier (dikke laag). 10 sec. 7°. In Lugol (J.J. K.) ... 10 sec. 8°. Vertikaal uitdruipen op fil- treer-papier (dikke laag) . 5 sec. 9°. Spoelen in Alcohol 96o/0 i min. Toestel van voren naar achteren met groote slinger-beweging bewegen. 10°. Flink spoelen onder waterstraal (beide zijden). 11°. In Waterige Fuchsine . . -I min. 12°. Flink spoelen onder waterstraal (beide zijden). 13°. Praeparaten uitschuiven en neerleggen op vel filtreerpapier. 14°. Met ander vel filtreertreer-papier drogen (vlakke hand overheen-strijken). 15°. leder praeparaat van achteren afvegen met filtreer-papier (om resten kleurstof te verwijderen). 16°. Ieder praeparaat drogen boven de vlam. 17°. Microscopisch bekijken. Men zorge er voor de bak met Lugol en Alcohol dadelijk na gebruik te sluiten; bij de Lugol b.v. tusschen 7» en 8»; bij den alcohol na 10» (om verdamping, en bij de Lugol den invloed van het licht tegen te gaan). Laat de flesschen gedurende het gebruik rustig op tafel staan (niet verplaatsen; kleurstof „neerslagen" komen anders in circulatie), totdat zy worden gereinigd, IX's weeks. De reiniging: De flesch met Aqaa Comm. wordt dagelijks, zoo noodig meer, ververscht. 1 X's weeks worden de flesschen met Kleurstof en Lugol geledigd; laat de vloeistoffen door papieren filters in schoone flesschen loopen. De bakken" worden goed gereinigd (die van het Gent. Violet desnoods met zoutzuren-alcohol, om de sterke kleurstof neerslagen te verwijderen). De vloeistoffen worden wederom in reine bakken terug gefiltreerd (door papieren filters). Op deze wijze kunnen dezelfde Kleurstoffen en de Lugol zeer lang worden gebruikt. Den Alcohol gebruike men, totdat deze door de daarin opgeloste kleurstof onbruikbaar wordt. Filtreeren door kool maakt deze wederom bruikbaar (zie pag. 22). Theorie der Methode: De spoeling in Aqua Comm. (zie onder 5°) heeft zooveel Gent. Violet weggespoeld, dat de inwerking der Lugol zeer moet worden verkort, om hetzelfde resultaat te verkrijgen; (werkt hier de Lugol den gewonen tijd in, zoo is het Gram + organisme negatief). De resultaten zijn nu geheel eensluidend geworden; zelfs bij „dikke" puspraeparaten, m.a.w. „Labiele" | 1 ^"«1 ^ Gram — Meningo-kokken - Gonokokken = Gram negatief ! Weefsel- Organ. J vochten „Labiele" ( j 2°°^ j" Gram + J Diptheriebac. — Anaerobionten = Gram positief , WeefselOrgan. J vochten Deze „massa" Gram-Kleuring moet niet het „gewone" Gram-praeparaat vervangen, doch moet alleen worden aangewend daar, waar het onderzoek om welke rede ook, tot een „massa" onderzoek aangroeit. (Gezondheidsdiensten — Centrale Laboratoria — Ziekenhuizen enz.) Onderzoek naar de bewegelijkheid der Microorganismen. Het vervaardigen van den Hangenden Druppel. Cl. 24 uur oude Agar-cultuur. b. ,»Hol" geslepen object-glazen. C. Dekglazen 18 mM. □ Utensiliën: d. Vaseline, in potje met penseeltje. e. Steriele physiologische zoutsolutie (85 % NaCl in water). ƒ. Platina oogje en naald. g. Lapje. Techniek der Methode: 1°. Maak hol objectglas stofvrij (afwrijven met lap), haal het even door de vlam en laat het afkoelen (tegengaan van condensatiedruppels). 2°. Omgeef het holletje van het objectglas door een dunne rand vaseline. (desnoods met „vinger" vaseline nog gelijkmatig rondstrijken). „Hol" geslepen objectglas Vaseline 3°. Maak dekglas stof- en vetvrij (haal hier voorzichtig door de vlam, daar het dunne glas spoedig springt), en leg het dekglas met de ontvette zijde naar boven op donkeren ondergrond (b.v. zwart-glazen plaat). 4°. Leg midden op dekglas, door middel van uitgegloeid oogje, een druppel steriele physiologische zoutoplossing. (Gebruik nooit Aqua Dest, de bewegelijkheid der bacteriën wordt hierdoor geschaad). Vloeit d ruppel ineens uit, zoo is het glaasje te warm. 5°. Breng door middel van uitgegloeide, afgekoelde naald een weinig cultuur in het druppeltje. 6°. Desinfecteer naald door uitgloeien en laat even afkoelen. 7°. Verdeel nu door middel van afgekoelde naald, de cultuur gelijkmatig door het druppeltje heen, zonder daarbij de druppel zelf uit te wrijven. 8°. Gloei naald uit. 9°. Leg nu objectglas met den hollen kant naar beneden gericht, op het dekglas, zoodat de holte het dekglas aan alle zijden goed bedekt. Holgeslepen objectglas Dekglas met druppel en draai nu het geheele praeparaat ineens om, zoodat de druppel in het holletje hangt. Dekglas met druppel. Holgeslepen objectglas 10". Druk, door middel van pincei, de hoeken van het dekglas op het objectglas, opdat de vaseline overal goed pakt. Houdt het praeparaat altijd Horizontaal in de hand, daar anders bij vertikalen stand de druppel zoo licht naar beneden loopt en uitvloeit. Zie voor „Microscopische Instelling" pag. 63. „ „ „Desinfectie" v. Praeparaat „ 63. Theorie der Methode: Micro-organismen vertoonen 2 soorten van bewegelijkheid: Eigen Beweging = De organismen (met zweepdraden — geeselharen) verplaatsen zich ten opzichte van elkaar, (wentelende, kronkelende, klievende of schietende beweging) Brown'sche Moleculair Beweging = De organismen (zonder zweepdraden) vertoonen een schokkende, trillende beweging en verplaatsen zich niet ten opzichte van elkaar, komen meestal weer op dezelfde plaats terug. Bij twijfelachtigheid der beweging, doodt men de cultuur door chloroformdampen (chloroform aan wattenprop, buis dicht paraffineeren, 24 uur laten staan) en vergelijkt deze dan ten opzichte eener „levende" 24 uur oude cultuur. Ook kan men den „hangenden druppel" in 3 of 5 % carbol maken (antisepticum), waarin de bacteriën afsterven. Men vergete hierbij nooit een afzonderlijken „controle-druppel" in zoutsolutie, ter vergelijking: Is de beweging der organismen van levende cultuur en \ gedoode „ gelijk ƒ beweging. Is de beweging der organismen van levende cultuur sterker "l Eigen dan die van gedoode „ ƒ beweging. Desinfectie „Hangende-druppel" praeparaat. Van den afgewerkten „hangenden-druppel" wordt het dekglas met pincet afgeschoven, in bak met Lysol 3% of Sublimaat '/ïooo i objectglas wordt daarin ook gedeponeerd (gloei pincet uit!) Na minstens 1 uur, glaasjes afspoelen in heet water en drogen. Het microscopisch onderzoek van het ongekleurde Praeparaat. Halve lichtsterkte. Bij voorkeur Kunstlicht. De Hangende Druppel. Optische samenstelling: Voor Zeiss als objectief de Homog. Olie Imm. 90('/]2) als oculair 10 x (4) jï Leitz „ „ „ ,, „ '/12 i) tt 4 „ Reichert „ „ „ „ „ '/12 „ „ = 4 „ Winkel „ „ „ „ „ 1.8 mM. „ ,, = 4 Vergrooting + 900 maal. Cederolie Brekingsindex N 1.515 Lensglas „ N = 1.515 Homogeen Objectglas \ N 15 20 systeem Dekglas ƒ " Stel het microscoop op de volgende wijze: a. Vlakke spiegel naar boven (evenwijdige stralen). b. Irisblende geheel geopend (deze wordt later gesloten). c. Abbe'sche Condensor geheel omhoog geschoven, totdat deze stuit, (het brandpunt ligt dan voor evenwijdige stralen in het object). d. Trek tubus uit: Voor Zeis zonder revolver tot 160 mM. „ met „ „ 145 „ „ Leitz zonder „ „ 170 „ „ „ met „ „ 152 „ „ Reichert zonder „ „ 160 „ „ „ met „ „ 145 „ „ Winkel zonder „ „ 170 „ i) jj niet „ ,, 155 „ Techniek der Instelling: Bij het instellen van het „hangende druppel-praeparaat", loopt men altijd groot gevaar, het objectief door het dunne dekglas heen te draaien. Is aan micrometer-schroef z.g. „terug-draai"-beweging, zoo leze men eerst pa^. 65 Indien men de volgende voorzorgen precies in acht neemt, zullen de kansen voor het breken van het dekglas uiterst gering zijn. 1°. Breng wat cederolie precies op den „hangenden druppel". 2°. Leg het „Hangende Druppel" praeparaat op de objecttafel en draai nu met de groote instelschroef, het oog steeds van ter zijde (langs tubus) gericht op het praeparaat, het objectief naar omlaag, met de linkerhand (tusschen duim en wijsvinger) het objectglas steeds een weinig bewegende, totdat het praeparaat door de Immersie even wordt geklemd, (ge weet nu zeker het praeparaat niveau voorbij te zijn). Onmiddellijk ophouden, niet verder naar omlaag draaien, anders drukt het objectief het dekglas stuk. Zorg zooveel mogelijk wanneer het objectief het praeparaat klemt, dat de Immersielens precies op den druppel staat. 3°. Kijk door oculair en zoek nu, door middel van den vlakken spiegel, eerst maximale lichtsterkte en sluit daarna pas de Irisblende tot op + de helft, zoodat er halfdonker ontstaat. 4°. Blijf door oculair zien, Houdt praeparaat met de linkerhand (tusschen duim en wijsvinger) vast, om het eventueel te kunnen verschuiven als de druppel ten opzichte der Immersielens toch niet gecentreerd mocht zijn, en draai nu, door middel van de micrometerschroef de Immersie langzaam naar omhoog, totdat het object duidelijk zichtbaar wordt (kleurlooze, dansende bacillenzwerm, waarin fraai geïsoleerde bacterien): Men draaie daartoe de kleine instelschroef: a. wanneer deze op zijde is aangebracht naar zich zelf toe. b, n n van achteren „ „ van rechts naar links, tegenovergesteld aan de klokwijzers. Wanneer het object op deze wijze toch gepasseerd mocht zijn, dan herhale men vooral de geheele instellingsmethode van voren af aan; (draai vooral nooit zonder eenig technisch houvast heen en weer, er bestaat dan groote kans door het dekglas heen te draaien). Mocht ondanks al deze voorzorgen, toch het dekglas stuk worden gedraaid, zoodat de glassplinters aan de Immersie-lens kleven, dan reinige men het objectief voorzichtig, (zie pag. 55.) Is het Infectieus materiaal dan wrijve men nog na met wat carbol (acid: phe- nyl. 3%) of alcohol 60%. Het „hangende druppel-praeparaat" kan niet bewaard worden. Zie voor „desinfectie" pag. 62. De Instelling met „terug-draai" beweging aan de Micrometer-schroef. Bij de meeste microscopen stuit de micrometer-schroef wanneer deze haar beide eindpunten heeft bereikt (boven of onder). Deze eindpunten zijn aangegeven rechts, op zyde, „langs tubus, door 2 „witte streepjes"; de stand van de micrometerbeweging op dat oogenblik, door een derde streepje A (zie fig.). Sommige microscopen bezitten echter een z.g. „terug-draai" beweging aan de micrometer-schroef, m.a.w.: heeft deze schroef haar eindpunt bereikt (hetzij boven of onder), zoo stuit zij niet, doch draait uit zich zelf in tegengestelde richting terug, niettegenstaande de persoon in dezelfde richting blyft doordraaien. Deze „omkeerbaarheid" der beweging gaat „oneindig" door, telkens wanneer het hoogste of laagste punt is bereikt. Dit maakt dat men vooruit nooit zeker is welke richting of men uitdraait. Bij den „hangenden-druppel" kan dit tot katastrophes aanleiding geven; men denkt b.v. naar boven te draaien, doch plotseling „draait de beweging om" (eindpunt bereikt), de tubus zakt inplaats van te rjjzen en het „dekglas", wordt toch stuk-gedraaid, ondanks de juiste voorzorgen. Ter voorkoming ga men nu als volgt te werk: 1°. Controleer eerst, wanneer met de micrometer-schroef naar boven wordt gedraaid, dat tubus ook inderdaad omhoog gaat (kijk daarbij naar streepje A, dit moet omhoog gaan). Is dit niet het geval, zoo moet men eerst doordraaien door een der eindpunten heen, teneinde de beweging „om te keeren 2°. Micrometer-schroef Eindpunt „boven" _ ste, nu gtreepje A djcht bjj onderste eindpunt, er is dan een ^ groote marge eer het bovenste „ „onder" —mm eindpunt is bereikt (zie fig.). Men kan de beweging zoo houden, door de eindpunten te vermijden, bij het microscopiseeren steeds tusschen beide streepen te blijven in-schommelen. Nu eerst kan, zonder gevaar, met de „eigenlijke" instelling van den „hangenden-druppel" worden begonnen (zie pag. 63 onder 1°). Onderzoek op Indolvorming. Indol (C8 H7 N) is een van de eindproducten der eiwit-splitsing, evenals het Skatol of Methylindol (C9 H9 N). Sommige bacteriën hebben het vermogen uit eiwitachtige lichamen b.v. pepton, Indol te produceeren. Men late hen daarvoor bij voorkeur groeien in suikervrije eiwitrijke vloeistoffen (liefst steriele 1 % pepton Witte, l/a % NaCl in water). Hierin late men de bacteriën minstens 2 X 24 uur bij gunstige temperatuur groeien. Indol reactie volgens Ehrlich. ®) Vereischte Reagentia: Paradimethyl-amidobenzaldehyd 2 Or. | R ï Itl bruine Alcohol 96% 190 \ A. (flesch bewaren HCI concentratum (25 %) 40 „ ) Persulfas Kalicus (K2 S2 Og) I Reagens als verzadigde waterige oplossing r b. (oxydatie middel) J Techniek der Methode: 1°. Neem van peptonwater-cultuur 2 deelen (giet plm. de helft der cultuur uit in bakje; vang den langsloopenden druppel met wattenprop op)- 2°. Voeg Réagens A toe 1 deel 3°. Voeg Réagens B toe 1 deel Bij aanwezigheid van Indol, roode verkleuring der geheele vloeistof. Denkbeeldige halveering der cultuur 1 deel Réagens B 1 deel Réagens A 2 deelen peptonwatercultuur Bij uitvoering der reactie, verdient het steeds aanbeveling een positieve Indolvormer (Bac. Coli) als contröle in te lasschen, om de réagentia te controleeren (Reg. A heeft neiging tot achteruit loopen). Theorie der Reactie: Het Paradimethyl-amido benzaldehyd verbindt zich met het Indol tot Rosindol, hetwelk in dit geval een leuco - (witte) base eener roode kleurstof is, die gemakkelijk door oxydatie (Reagens B) in de roode kleurstof is over te voeren. Deze reactie is zoo gevoelig dat 'ndol er nog mede kan worden aangetoond. 1) Dr. A. Böhme, Centralbl. für Bakt. Abt. I orig. Bd. 40, 1906. Indol reactie volgens Kitasato-Salkowsky. ') Vereischte Reagentia: H2S04 concentratum (98%). KN00 (Nitris Kalicus) 0.02 % oplossing in water. Techniek der Methode: 1°. Voeg bij plm. 10 ccm peptonwater-cultuur eenige druppels H2S04 concentr. 2°. Houdt buis schuin en laat voorzichtig schuin 1 ccm KNOz oplossing indruppelen (met pipet). 3°. Houdt buis voorzichtig recht en kijk op scheidingsvlak, daar waar reagentia met de cultuur-vloeistof samenkomen. Bij aanwezigheid van Indol, rood violette ring. Theorie der Reactie: Indol -j- HN02 (Salpeterigzuur) geeft een roode verkleuring. Het H2S04 maakt nu het HN02 uit het zout KN02 vrij, waardoor het HN09 zich gemakkelijk met het Indol kan verbinden. Deze reactie is minder gevoelig en minder karakteristiek voor Indol dan die van Ehrlich. Nitroso-Indol reactie of Cholerarood reactie volgens Dunham 2) - Salkowsky '). Vereischt Reagens: H2S04 concentratum (98 %). Techniek der Methode: 1°. Qiet bij peptonwater-cultuur scheutje H2S04 concentratum. Bij aanwezigheid van Indol, roode verkleuring der geheele vloeistof. Theorie der Reactie: Vibrionen in het algemeen zijn denitrificeerende organismen; zij zullen dus de nitraten die in het Keukenzout aanwezig zijn, afbreken tot nitrieten; hier is dus een extra toevoeging van KN02 overbodig. Het door henzelf gevormde nitriet (NaN02) verbindt zich nu met het toegevoegde H2S04, waardoor het HN02 (salpeterigzuur) vrij komt. Het HNÖ2 verbindt zich nu met het Indol en geeft de roode verkleuring. 1) E. Salkowsky. Virchow's Archiv Bd. CX 1887. S. Kitasato. Zeitschr. f. Hyg. Bd. 7 1889. W. Frieber. Centr.bl. f. Bakteriol. Bd. 87 1922. 2) E. Dunham. Zeitschr. f. Hyg. Bd. 2 1887. Het kleuren van Zuurvaste organismen. (Bac. Tuberculosis - Bac. Leprae - Bac. SmegmatisBacteriënsporen enz. enz.) Sporen-kleuring volgen» Klein. ') Eenigszins gewijzigd door M. VAN RIEMSDIJK. a. 24 uur oude aardappel- of agarcultuur. b. Steriele reageerbuis. c. „ physiologische zoutsolutie (0.85 % NaCl in water.) Utensiliën: d. Objectglazen. uicnbiiicn. * Bekerglas + water e. Waterbad 80 a 90« C. J> en thermometer J boven Bunsen-brander f. Platina oogje. g. Glaspotlood. Kleurstoffen en Reagentia: a. Carbol Fuchsine ) Zie pag. 70. b. H2S04 1% c. Waterig Methyleenblauw i of i Zie pag. 70. Loeffler's Methyleenblauw ) Techniek der Methode: 1°. Doe in steriele reageerbuis + 1 ccm steriele zoutsolutie. 2°. Neem met uitgegloeid, afgekoeld oogje wat van de cultuur, en wrijf dit uit in reageerbuis, even boven de vloeistof, tegen den glaswand aan. Wanneer alles goed is fijngewreven, wordt het van lieverlede met de zoutsolutie vermengd. De suspensie moet ongeveer melkwit zien. 3°. Gloei oogje uit. 4°. Voeg ongeveer evenveel Carbol Fuchsine toe, als er bacillen-suspensie is. 5°. Verwarm nu de roode suspensie in waterbad van pl.m. 80 a 90° C 10 min. 6°. Laat de vloeistof afkoelen en uitzakken; Iaat daarvoor de buis in vertikalen stand staan, pl.m. 3 a 5 min. Kleurstof neerslagen, enz., zakken naar den bodem en de bovenste vloeistoflagen zullen helderder worden. 7°. Maak nu van de bovenste vloeistoflaag (roer vooral niet) gewone uitstrijkpraeparaten (eerst oogje water en daarna 1 oogje roode suspensie) wrijf flink uit, droog en fixeer op de gewone wijze. (Zie pag. 53) 1) Alex. Klein. Centralbl. für Bakt. Abt. 1 org. Bd. 25, 1899. 8°. Ontkleurenin lo/o H2S04 (even indoopen) voor Bac.Subtilis 1 a 2 sec. voor B. Anthracis 3 a 4 sec. Ontkleuringstijd slechts bij benadering aan te geven. Iedere cultuur eischt zijn eigen ontkleurings-duur; dit alleen aan praeparaat na te gaan. 9°. Afspoelen onder den waterstraal. 10°. Nakieuren met Waterig Methyleenblauw 5 min. of „ „ Loe/fler's „ 2 min. 11°. Afspoelen, drogen en bekijken (Zie pag. 53 en 54). Is het praeparaat mislukt, zoo kunnen van dezelfde suspensie telkens nieuwe praeparaten worden gemaakt. Zie nog voor het nakieuren pag. 57 onder IR Theorie der Methode: (Zie pag. 71) Sporen moeten duidelijk rood gekleurd zijn. Bacteriën „ „ blauw „ „ Zijn Sporen bleek tot kleurloos, zoo is er te lang ontkleurd geworden „ Bacteriën nog roodachtig, „ moet er langer „ worden Sputum onderzoek. Dubbelkleuring van Ziehl - Neelsen voor T uberkelbacillen. a. Diep bord met zwarten bodem. (Lak met spiritusvernis bodem zwart. Of neem glazen photographie-schaal en plaats deze op zwarten ondergrond b.v. zwart papier). b. Objectglazen. c. Platina oogje. d. Glaspotlood. Utensiliën • e* Bunsenbrander met Spaar-vlam en 10. Objectglashouder van zwaar Koper, zie fig. A. of 20. Bakje van Zink lang 15 cM. | breed 5 „ / hoog 2 „ J Zie fig. B. rustend op „drie-poot" met „gaasje". Randen van bakje moeten waterpas zijn. Kleurstoffen en Reagentia: a. Carbol Fuchsine. ! b. H2S04 5o/o c. Alcohol 60 0/0 d. Waterig Methyleenblauw j of Loeffler's Methyleenblauw J Acid Phenyl. Chryst. ... 5 Aquae Dest 100 Fuchsini 1 Alcohol 96 % 10 Ontkleuringsmiddelen. Sol. Sat. Methyleenblauw in alcohol 96 % .... 10 Aquae Dest 90 Sol. Sat. Methyleenblauw in alcohol 96 % ... 30 V10000 Hydras Kalicus (K O H) 100 (lccM 1% KOH op 100 water). Techniek der Methode: 1°. Maak 2 objectglazen stof- en vetvrij (zie pag. 53) en plaats een flinke glaspodloodstreep op pl.m. 1 cM. van den kant, op het eene objectglas links, op het andere objectglas rechts (zie teekening). 2°. Giet Sputum uit in diep bord of schaal (met zwarten bodem; het is dan veel gemakkelijker de samenstelling en kleur der verschillende Sputumdeeltjes te beoordeelen). 3°. Zoek nu de geelachtig-groene harde stukjes uit; zijn deze er niet dan de meest etterige deelen van het sputum, en maak daarvan gelijkmatige uitstrijkpraeparaten op de volgende wijze: a. Leg wat sputum (niet te weinig) met oogje op objectglas I. b. Gloei oogje uit. c. Wrijf nu met 2e objectglas het sputum gelijkmatig uit; trek daartoe de objectglazen telkens geheel van elkaar en oefen daarbij tevens eenigen druk uit (plm. 5 min.) zie pijltjes op teekening. Tusschen deze bewerking door, haalt men de objectglazen telkens even door de vlam, de eiwitten coaguleeren een weinig, waardoor de massa taaier wordt, en het gelijkmatig uitstrijken veel gemakkelijker gaat. Glaspotloodstreep Olaspotloodstreep Men houde met het uitwrijven eerst op, nadat het sputum bijna is droog gewreven en gelijkmatig over het objectglas is verdeeld. 4°. Laat praeparaten goed drogen (aan de lucht of boven de vlam) en fixeer ze, (enkele malen door de vlam halen). 5°. Kleur met Carbol Fuchsine onder zachte verwarming, tot duidelijke dampvorming (zie fig. A of B) . . . . 5 min. Indien er kleurstof van het praeparaat verdampt, zoo voege men nieuwe toe. A Regel eerst brander (spaarvlam) Leg Vul bakje met Water. Laat dit goed praep. op toestel en giet kleurstof op. koken (duidelijke dampvorming). Leg Wanneer „dampvorming" optreedt laat praep. op bakje en giet kleurstof op. dan inwerken. ... 5 min. | Laat zoo doorkoken . . 5 min. 6°. Giet kleurstof af (bij B in het bakje). 7°. Doop praeparaat in de H2S04 5 o/o I a 2 sec. 8°. Afspoelen in Alcohol 60 u/0l totdat er geen kleurstof meer afloopt en het praeparaat een licht rose tint heeft gekregen. Blijft het praeparaat te rood, dan behandele men het opnieuw in de H2S04 en Alcohol, totdat de vereischte licht rose tint is verkregen. 9°. Flink afspoelen onder den waterstraal. 10°. Nakieuren met Waterig Methyleenblauw 2 min. of „ Loeffler's „ 1 min. 11°. Afspoelen, drogen en bekijken (zie pag. 53 en 54). Voor degenen wier oogen weinig gevoelig zijn voor het contrast rood-blauw, wordt aanbevolen inplaats van het methyleenblauw, een waterige Malachiet-groen oplossing (dezelfde verhoudingen als voor het waterig methyleenblauw) of Bismarckbruin (zie pag. 57) te gebruiken. Theorie der Kleur-methoden volgens Klein en Ziehl-Neelsen. Het is een eigenschap der zuurvaste organismen, dat zij moeielyk kleurstof opnemen (zie pag. 19). Hebben zij zich echter door krachtige kleurstoffen en onder verwarming eindelijk laten kleuren, dan houden zij de kleurstof tegenover de gewone ontkleuringsmiddelen (zuren, alcohol), ook veel inniger vast (zie pag. 16). De kleuringen van Ziehl-Neelscn en Klein zijn geheel op deze eigenschap gebaseerd. Zuur-vaste organismen zijn dus duidelijk rood gekleurd. Vasthouden der Carbol Fuchsine ten opzichte van H2S04 en Alcohol, weefselcellen Zuur-losse organismen zün dus „ blauw gekleurd + bacteriën Loslaten der Carbol Fuchsine in de H2S04 en Alcohol. Nakleuring door Methyleenblauw. Sublimaat-methode tot ophooping van Tuberkelbacillen in Sputum volgens Nakao Abe.') a. Stopflesch (wydmondsch), desnoods gewone w^dmondsche flesch met goed sluitende kurk van pl.m. 100 Gr. Utensiliën: b Vaseline c. Centrifuge met Centrifugeerbuizen. Vereischte Vloeistof: Sublimaat . . 2 gr. NaCI .... 10 „ Aqua Dest. . .1000 „ Techniek der Methode: Schud-vloeistof. Blijft lang goed. 1°. Qiet sputum in flesch 1 deel (zooveel mogelijk fluimen, zoo min mogelijk slijm). 2°. Voeg hierbij schudvloeistof 3 deelen. 3°. Schudt dit mengsel in stopflesch (waarvan de stop of kurk met vaseline is ingevet en goed aansluit) tot homogenisatie p.lm. 10 min. 4°. Qiet de vloeistof in minstens 2 centrifugeerbuizen en centrifugeer „ 10 min. 5°. Maak van de centrifugaten, nadat de bovenstaande vloeistof is afgegoten, gewone uitstrijkpraeparaten (zie pag. 53, extra toevoeging van water hier overbodig) fixeer en kleur volgens Ziehl-Neelsen (zie pag. 71). Theorie der Methode: Onder invloed van het sublimaat en het keukenzout worden de zoo rijkelijk in sputum aanwezige eiwitten neergeslagen; door het centrifugeeren worden deze en de tuberkelbacillen op een Hoop geslingerd. Deze methode is voor de gewone praktijk zeer aan te bevelen. 1) Nakao Abe. Archiv. für Hygiene Bd. 67 pag. 272. Antiformine-Chloroform methode tot aankweeking en ophooping van Tuberkelbacillen in Sputum volgens Loeffler.') a. Kook-kolf van 100 gr. Utensiliën: b «aat2las van 100 - c. Fleschje van pl.m. 25 gr. of meer. d. Centrifuge met centrifugeerbuizen. Vereischte Vloeistoffen: Antiformine 1 Antiformine als zoodanig 1 50 % ^ 4- in den handel I . „ , - - (100 pCt.) I A1ua Dest- aa Chloroform. ... 10 ccm. ) ChloroformAlcohol 96 %. . . 90 „ | Alcoholmengsel. Het Antiformine is ook zelve te bereiden: Hypochloris calcicus 20 pCt. pro Analysi 240 gr. Anti- | Carbonas natricus 500 „ formine I Hydras natricus 75 „ ' Aqua Dest 700 „ Meng de zouten langzaam met de 700 ccm. water en laat minstens 1 uur staan. Filtreer de oplossing in maatglas en na volkomen filtratie, wasch het filter na, totdat het vloeistofvolume op 1 L. is gebracht. Voor het gebruik: Antiformine -f- Aqua Dest aa Techniek der Methode: 1°. Neem tamelijk veel sputum in kook-kolfje. 2°. Voeg evenveel 50 o/o Antiformine toe. 3°. Kook dit mengsel goed tot homogenisatie. 4°. Voeg bij 10 ccm. van het gekookte sputum-antiformine mengsel, iy% ccm. chloroform-alcoholmengsel en schudt dit goed in fleschje. 5°. Verdeel de vloeistof in centrifugeerbuizen en centrifugeer plm. 10 min. 6°. Neem nu de centrifugaten (schijven), nadat de bovenstaande vloeistof, (Antiformine) is afgegoten, en maak daarvan gewone uitstrijkpraeparaten (pag. 53), extra toevoeging van water overbodig, fixeer en kleur volgens Ziehl-Neelsen. (zie pag. 71). Om het materiaal beter op het objectglas te doen kleven, neemt men een weinigje sputumslijm om het centrifugaat mede uit te wrijven. Theorie der Methode: Het Antiformine lost alle organische bestanddeelen in het sputum op, behalve de zeer resistente tuberkelbacillen. Het Chloroform waarmede de Tuberkelbacillen en andere was-achtige stoffen zich beladen hebben, zal door het zeer hooge soortelijk gewicht, bij het centrifugeeren op den bodem worden uitgeslingerd en de Tuberkelbacillen. welke specifiek even zwaar zijn geworden, medeslepen, die nu in de schgf te vinden zijn, welke zich even boven de Chloroform (tusschen Chloroform en Antiformine) bevindt. 1) Loeffler. Deutsche Med. Wochenschr. 27 Oct. 1910. Het aantoonen van de Babes-Ernst'sche Poolkorrels der Diphtheriebacillen. Poolkleuring volgens Neisser. ') Eenigszins gewijzigd door SCHELLER. a. 24 uur oude cultuur van Loeffler's Serum of Eierdooier agar. 2) , b. Maatglaasje van plm. 10 ccm. Utensilien; c Ai|es wat voor een „eenvoudig uitstrykpraeparaat" noodig is (zie pag. 53). Vereischte Kleurstoffen: Methyleenblauw (Höchst) 1 J Alcohol 96% . . . 20 Oplossing A. Aquae Dest . . 1000 i & Acid. aceticum glaciale . 50 J Kristalviolet (Höchst) 1 ) Alcohol 96 o/o . . 10 [ Oplossing B. Aquae Dest . . . 300 j Chrysoïdine ... 1 j Oplossen in warm water 300 ^ Oplossing C. Filtreeren ) Techniek der Methode: 1°. Maak gewoon uitstrijkpraeparaat en fixeer dat op de gewone wijze. (Zie pag. 53). 2°. Doe van oplossing A in maatglas 2 deeleti \ ^ Meng van oplossing B in zelfde maatglas 1 deel \ 3°. Kleur het praeparaat met AB 15 a 20 sec. 4°. Spoel heel kort onder de kraan. 5°. Kleur na met oplossing C 15 a 20 sec. 6°. Spoel heel kort onder de kraan of geheel niet spoelen. 7°. Droog tusschen filtreerpapier en verder boven de vlam; onderzoek microscopisch (zie pag. 54). Theorie der Kleuring: De Poolkorrels (Volutin) kleuren zich door de 1ste kleurstof (Methyleenblauw-kristal violet) veel intenser (blauw-zwart), dan het bacillen-lichaam. Het protoplasma neemt heel zwak het chrysoïdine op, is dus heel licht bruin gekleurd (zie pag. 16 en 18). 1) M. Neisser en H. Gins. Diphtherie, {Kolle und Wassermann Bd. V2 M. van Riemsdijk. Centralbl. für Bact. Abt. 1 orig. Bd. 75 1914 2) Capaldi. Centralbl. für. Bact. Abt. 1 orig. Bd. 20, 1896. Kapselkleuring volgens M. van Riemsdijk') Bac. Anthracis, Bac. Pneumoniae, Pneumococcus, Bac. Lactis Aerogenes, Bac. Capsulatus Mucosus, Streptococcus Capsulatus, Micrococcus Tetragenus Septicus, enz. Cl. Dierlyke vochten of weefsels waarin de Kapsel-bacteriën zijn besloten, of: 24 uur oude reincultuur, liefst van „eiwitrijken" voedingsbodem (Ascitis agar, Loeffler's Serum, enz.) b. 2 Pipetten van 1 ccm. inhoud. Utensiliën: Agglutinatiebuisje. d. Objectglazen. e. Reageerbuis. f. Platina oogje. g. Glaspotlood. Kleurstoffen en Reagentia: I Argentum i a. Protargol oplossing in Aqua Dest Proteinieum Bayer 1:200 I In donk. bewaren Strooi de Protargol op de hoeveelheid Aqua | mGr op | Dest in reageerbuis (het oplossen gaat dan zoo- | jq ccm. Aqua Dest | veel beter). De oplossing kan niet bewaard worden, voor iedere reeks proeven op nieuw maken. b. Waterige Eosine-oplossing j Eog?üeb£relb ] 1:50 c. Carbonas Natricus 20 % In stopflesch met goed sluitende, ingevette stop (om C02 verlies tegen te gaan). 1 ccm. Eosine-oplossing 1 :50 I Voeg bij , uit * 1 druppel ï ccml na2co3 20 % l pipet' J Alkalische Eosine-oplossing Techniek der Kleuring. / uit \ 1°. Breng 5 druppels Protargol-oplossing li ccml in agglutinatiebuisje. " pipet / 2°. Neem met uitgegloeid oogje enkele oogjes dierlijk materiaal of 1 oogje reincultuur, en wrijf dit even boven de vloeistof, tegen wand van buisje fijn. Nadat alles goed is fijngewreven, meng van lieverlede met de vloeistof. 3°. Vozgevenveelyüus 5 druppels Alkalische Eosine-oplossing (ï ccm] toe. ' pipet I 1) M. van Riemsdijk. Centr.bl. für Bakteriologie Abt. I, orig. 86 Bd. Hft. 3. 4°. Goed mengen, door heen en weer schudden. 5°. Rustig laten kleuren . 10 a 20 min. 6°. Op goed gereinigd objectglas, met uitgegloeid oogje, uit vloeistof, dun en gelijkmatig praeparaat maken. 7°. Laat praeparaat aan de lucht drogen, (niet verwarmen). 8°. Met Cederolie onmiddellijk microscopisch bekijken. Theorie der Kleurmethode: Het. Protargol, dat den bodem van het gansche praeparaat uitmaakt, heeft zich met het Eosine gekleurd, zoodat het geheele gezichtsveld rood is gekleurd. De bacteriën kleuren zich eveneens met het Eosine en zijn dus ook rood gekleurd. De kapsels blijven ongekleurd, zijn als witte uitgespaarde hoven om de bacterie-lichamen te zien, dikwijls omgeven door rooden rand. Kapselkleuring volgens A. Johne.]) Cl Dezelfde als voor het „eenvoudige uitstryk Praeparaat". (Zie pag. 53). b Dierlyke vochten of weefsels waarin de Kapsel-bacteriën zijn besloten, of: Utensiliën: 24 uur oude reincultuur, liefst van „eiwitrijken" voedingsbodem (Ascitis agar, Loeffler's serum enz.) C Bunsen-brander met spaarvlam en objectglashouder (zie pag.71) d Dekglazen 18 m.M. □ Kleurstof en Réagens. Solut. Aquos. Gentiana-violet 2 o/o Acid. Aceticum 2% Techniek der Kleuring. 1°. Maak dun, gelijkmatig uitstrijkpraeparaat en fixeer dit op de gewone wijze (zie pag. 53). 1) A. Johne. D. Zt. f. Tiermed. XIX 1893. 2°. Kleur met Gentiana-Violet, onder zachte verwarming (breng praeparaat met kleurstof op objectglashouder boven brander en verwarm door „spaarvlam" (zie pag. 71). tot dampvorming I a 2 min. 3°. Spoel onder waterstraal. 4°. Differencieeren in 2% azijnzuur 5 a 10 sec. 5°. Spoel onder waterstraal. 6°. Laat gereinigd dekglas vallen op met water bedekt praeparaat (insluiten in water). 7°. Microscopisch met Cederolie bekijken. Theorie der Kleurmethode. Het Bacterielichaam is violet gekleurd, de veel moeilijker kleurbare kapsel (verwarming) zal de kleurstof in het azijnzuur gedeeltelijk hebben losgelaten, zoodat zij als veel lichtere hof om het Bacterielichaam te zien is. Door het „insluiten in water" zwelt de door het fixeeren geschrompelde kapsel wederom op. „Donkerveld" Belichting voor het aantoonen van Zweepdraden, Bacteriën, Spirochaeten, enz., enz. Cl. Microscoop Objectief I Oculair ^ Homogene Olie-Immersie '/i2 of Sterk „droog systeem" (Apochrom: 3 h 4 m.M. met dekglas1 correctiering. 4 of 5 of , Komp. Oculair 8 of 12. b. Paraboloïd Condensor Siedentopf, verkrijgbaar bij Zeiss. C. Blende voor olie Immersie-lens f/i2 of Blende voor sterk „droog systeem". Utensiliëll: d. Dekglasmeter om dikte dekglas te meten, dit alleen bij gebruik van „droog systeem". e. Cederolie N 1.515. ƒ. Wolfraam-booglamp Philips of Nernstlamp (zie pag. 80). g. Objectglazen (niet meer dan \ 1.1 m.m. dik). I Minstens 24 uur tevoren in Dekglazen 18 mM. □ 0.17 mM. j stopflesch met alcohol 96%. dik. (Zeiss, zie nog pag. 43). ) h. Steriele physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl. in water). i. Reincultuur Bacteriën (18 a 24 uur oud) of Luetisch mate¬ riaal (versch). j. Platina oogje. k. Steriele pipet % c.cM. inhoud. /. Linnen lapje (zakdoek!) Techniek der Methode: 1°. Schuif Abbe'sche condensor uit het microscoop „ Paraboloïd „ in „ „ zoo hoog mogelijk naar boven, totdat deze stuit. 2°. Schroef de Homogene Immersie-lens af en breng daarin de blende en bevestig de lens wederom. Bij gebruik van het „droog systeem" doet men dit eveneens. 3°. Zorg voor alles dat object- en dekglazen van buitengewone reinheidz\\u. (Oeen stofjes, noch oneffenheden; deze maken het „donkerveld" onmogelijk). Neem object- en dekglazen uit den alcohol en wrijf deze met linnen lapje heel voorzichtig af. Bij energisch wrijven, wordt het glas electrisch en trekt duizende stofjes aan. Bepaling „dikte" Dekglas: Wordt het sterke „droog systeem" als objectief gebruikt, zoo moet de dikte der dekglazen eerst worden gemeten in den dekglasmeter, (voor Immersie-lens is dit niet noodig). Wordt er b.v. een dikte van 0.13 mM. gevonden, zoo wordt de • correctiering van het objectief op 13 geplaatst (zie fig.). | | ■ | ■ De correctiering bewerkt, dat de lenzen in het objectief ten | opzichte van elkaar worden verschoven. 13 12 11 Om globaal de dikte van het dekglas vast te stellen, doe men als volgt: Meet de dikte van het geheele stapeltje dekglazen uit het doosje, deel dit getal door het aantal dekglazen, waardoor de gemiddelde dikte per dekglas is vastgesteld. Breng dit cijfer op den correctiering der lens. 4°. Breng door middel van pipet, druppeltje zoutsolutie midden op objectglas. 5°. Meng hierin, door middel van uitgegloeid oogje, het te onderzoeken materiaal (jonge bacterie-cultuur, zweepdraden zijn dan op zijn fraaist) of Luetisch materiaal (versch ontnomen). 6°. Laat nu op den druppel het dekglas vallen, de druppel zal zich onder het dekglas-oppervlak gelijkmatig verspreiden. Het is noodzakelijk dat de vochtlaag onder het dekglas dun is. Mocht er te veel zoutsolutie zijn genomen (te groote druppel), zoodat het dekglas er af glijdt, zoo zuigt men de overtollige vloeistof met filtreerpapier langs de randen van het dekglas af, totdat het dekglas er behoorlijk op blijft rusten. Ten strengste zijn „luchtbelletjes" in den druppel te vermijden, welke bij te weinig zoutsolutie ten opzichte van het dekglas-oppervlak of bij verkeerd aandrukken, kunnen optreden. Zij geven een zoo sterke lichtbreking dat ervan een eigenlijk „donkerveld" geen sprake meer kan zijn. Zijn zij aanwezig, zoo kan men, door het objectglas in beide handen te nemen en dit heen en weer te bewegen, de luchtbellen nog wel eens „weg laten glijden", zoo niet, dan moet het praeparaat worden overgemaakt. De Microscopische Verlichting. De verlichting voor „donkerveld-belichting" moet sterk zijn. Deze is te bereiken door de Nernstlamp of zeer aan te bevelen de Wolfraambooglamp van Philips, 220 volt Wisselstroom voor 1.3 Amp. of 2.5 Amp. met voorschakel-weerstand. Deze lamp geeft een zeer fraai en constant licht, 2000 kaarsen sterk. Voor alles moet worden gezorgd, dat het kunstlicht alleen daar straalt, waar het noodig is, dus op den microscoopspiegel en niet elders. Bijschijnsels mogen niet voorkomen, de microscopist moet zooveel mogelijk in donker zijn (sluiten der gordijnen, enz.), daar het oog niet door ander licht mag worden afgeleid, dan alleen en uitsluitend door de sterk lichtende bacteriën, enz. in het donkere veld. De Philipslamp moet dus worden omgeven door een zwart metalen koker, met opening ter hoogte van de bolletjes (voor het doorlaten van den „lichtkegei"). Deze koker kan gemakkelijk op het montuur rusten. Een kolfje met water gevuld, (in statief) voor en ter hoogte van de lichtbron geplaatst, zorgt voor een zeer fraai diffuus licht. VoorschakelWeerstand Philips' Wolfraam-booglamp. De Wolfraam-booglamp is zelfontstekend; bij inschakelen van den stroom ontstaat een glimontlading in de lamp, die door ionisatie van het gas den boog tusschen de wolfraam-bolletjes doet ontstaan. Voor deze „glimontlading" is de spanning van 220 Volt noodzakelgk. De lamp moet branden met een voorschakelweerstand: de spanning aan den boog is ± 25 Volt, 195 Volt moet dus door den weerstand worden opgenomen. Te hooge of te lage stroomsterkte doet de lamp zwart worden; men lette dus op een „weerstand" van de juiste grootte (stroomsterkte staat op „lamp-huls" aangegeven). De Microscopische Instelling. 1°. Breng druppel Cederolie boven op de lens van den condensor, en laat condensor een weinig dalen. 2°. Leg praeparaat op objecttafel, draai condensor zoo hoog mogelijk omhoog, zoodat de druppel Cederolie van den Condensor gelijkmatig door den druk van het objectglas uitvloeit. (De luchtlaag tusschen Condensor en Objectglas wordt op deze wijze „gehomogeniseerd"). Komen er toch luchtbellen in den druppel Cederolie, zoo herhaalt men deze bewerking, alleen brengt men nog een druppel cederolie aan de onderzijde van het objectglas. 3°. Breng druppel Cederolie midden op dekglas (dit is voor het „droogsysteem" overbodig). 4°. Draai objectief naar beneden, totdat er duidelijk contact bestaat met den Cederoliedruppel. 5°. Neem Oculair uit tubus en zoek nu, terwijl men door ledige tubus ziet, door middel van den vlakken spiegel, naar de juiste belichting (sterk doch gelijkmatig verlicht lens-oppervlakje, waarin duidelijk, doch miniem klein, de hel verlichte organismen voort dansen). Het licht moet schuin in den Condensor vallen; dit vereischt eenige oefening. 6°. Breng Oculair wederom in tubus; is de juiste belichting bereikt grijs-bruine tot zwarte tint van liet gezichtsveld ZOO stelt men het praeparaat met de micrometerschroef fijn in. „Bacterien" komen te voorschijn als sterk lichtbrekende lichaampjes op zwarten ondergrond, de zweepdraad als uiterst fijne geunduleerde draad aan het lichaam hangende (Spiriiium Voiutans). Is de beweging der micro-organismen zeer snel, zoo is de zweepdraad onzichtbaar, het oog kan deze snelle heftige bewegingen niet volgen. Laat het praeparaat rustig onder het microscoop liggen, totdat de beweging kalmer wordt en daarmede de zweepdraad vanzelf zichtbaar wordt. „Spirochaeten" vertoonen zich als uiterst fijne „kurkentrekkers"; soms als een „rij lichtende punten" achter elkaar, dit laatste alleen wanneer de windingen van denspirochaet bovenop — — — worden gezien. (Zie fig.) ~ ' » — Spirochaete Pallida ^ Dentium l ^'e v00r Morphologische verschillen en Overige Spirochaeten J verschillen in Beweging pag. 90. Theorie der Donkerveld-belichting. Abbe'sche Condensor. Paraboloïd Condensor Siedentopf. Centrale- en Randstralen gaan vrij door, geen blende. Alleen Randstralen gaan door, centrale stralen worden door blende teruggekaatst. Condensor van boven gezien Condensor van boven gezien Lichtstralenkegel met zeer groote Num. Apert, zoodat zooveel mogelijk licht binnentreedt. (Rand- en centrale stralen). Lichtstralen gaan vry door. Brandpunt in het object bij vlakken spiegel. Licht wordt door breking verzameld, zeer sterke verlichting van het object. Belichting van object door direct licht. Alleen Randstralen gaan door, worden in het brandpunt gereflecteerd, gaan dus niet vrij door. Centrale stralen worden door blende A teruggekaatst. Licht wordt door spiegeling verzameld. Belichting van object door indirect licht, n.m. door afgebogen stralen. Object ) Spirillum Volutans + J Spirochaeten. Object Spirillum Volutans + Spirochaeten. Helderveld Condensor (Abbe) Zichtbaar alleen Spir. Volutans Donkerveld Condensor (Siedentopf) Zichtbaar I Spir. Volutans I -f-Zweepdraden ) -j-Spirochaeten. De „eenvoudige Donkerveldbelichting" en de „donkerveld belichting te samen met het Ultramicroscoop", stellen ons in staat lichaampjes te zien welke bij de gewone microscopische belichting (Helderveld) slecht te zien zijn of onzichtbaar zijn (Ultramicroscopische deeltjes, ciliën enz.). Dit nu is niet het gevolg van een grooter „oplossingsvermogen" der lenzen, maar van den aard der verlichting van het object. Het principe der Donkerveldbelichting, dus ook van het Ultramicroscoop, berust op het aloude feit, dat lichtende voorwerpen op donkeren (zwarten) ondergrond oneindig beter zichtbaar zijn, dan op lichten ondergrond. Als voorbeeld hiervan, zijn de overdag onzichtbare sterren te noemen, welke aan den zwarten avondhemel als lichtende punten schitteren. Bij de donkerveldbelichting is het dan ook voor een groot deel aan deze sterke contrastwerking (licht-donker) te danken, dat de voorwerpen zooveel duidelijker zichtbaar worden, n.m. als sterk lichtende „puntjes en deeltjes", welke bij helderen ondergrond haast onzichtbaar zijn. De Donkerveldbelichting geeft geen meerdere details of fijnere structuren te zien, dan het gewone microscoop en de kleurmethoden ons in staat stellen van te zien, alleen geeft zij alles beter te zien. De verlichting in het Donkerveld is reeds in 1838 door Reade beproefd: „Blackground Illumination". Siedentopf en Zsigmondy hebben door de volmaking van het „paraboloïd" hetwelk in 1856 door Wenham reeds was ingevoerd, deze methode tot de huidige technische hoogte gebracht. Het principe van Siedentopf's Paraboloïd Condensor is afgeleid van het Phenomeen van Tyndall: Voorbeeld 1= Onzichtbare stofdeeltjes worden in de lucht zichtbaar, wanneer in een donkere kamer door een spleet zonlicht binnentreedt, mits het oog van den waarnemer loodrecht staat op den invalshoek van den bundel zonnestralen, welke de deeltjes belichten. Voorbeeld 11= Wordt een breede reageerbuis, gevuld met een Kolloïdaleoplossing, in den lichtkegel van een sterke lichtbron gehouden (booglamp), zoo wordt een deel der vloeistof hel verlicht. Dit hel verlichte deel zendt nu een „blauwachtigen" lichtkegel uit, die loodrecht staat op den hoek van inval der oorspronkelijke lichtstralen. Dit „blauwachtige" licht bestaat uit „afgebogen" stralen; deze zijn blauwachtig aangezien de stralen van de geringste golflengte (blauw-violet) het sterkst worden „afgebogen" (zie fig.). Het „afgebogen" licht is alzoo zwakker dan het „oorspronkelijke" licht. „Oorspronkelijke" lichtstralen welke dwars doorde „deeltjes" heengaan. „Afgebogen" lichtstralen. Dit principe heeft Siedentopf optisch bereikt door een condensor te slijpen in den vorm van een paraboloïd" (Plano-Convexe lens, waarvan de convexe kromming een rotatie-paraboloïd is), waarbij alleen „randstralen" binnen kunnen treden, alle centrale stralen door een „blende" met spiegelend oppervlak A, totaal worden teruggekaatst. Randstraal Objectieflens Afgebogen straal De optische as van het microscopische lenzenstelsel, dus ook die van het oog van den waarnemer, staat + loodrecht op den invalshoek van den randstralen-kegel welke door den paraboloïd Condensor binnen treedt. Deze randstralen-bundel wordt nu in het brandpunt o van den Condensor, dat juist in de bovenste laag van het objectglas gelegen is, daar waar de stralen de lucht ontmoeten, totaal gereflecteerd. De lichaampjes (Bacteriën, Stofjes, enz., enz.), welke juist in deze zone gelegen zijn, zijn echter door dit sterke licht aangeraakt geworden en verlicht, zij worden nu „zelflichtend"; een gedeelte van dit licht wordt door hen „afgebogen", zij zenden m.a.w. zelf lichtstralen uit, en deze, van den oorspronkelijken randstralen-kegel „afgebogen" lichtstralen worden in het microscoop tot een beeld vereenigd en geven de deeltjes, als sterk lichtende lichaampjes (zonnetjes) weer. Het oog ontvangt dus geen direct licht van de lichtbron, doch afgebogen licht; dit licht is zwakker, vandaar dat de oorspronkelijke lichtbron zoo sterk moet zijn. Er komt dus in den Condensor weinig, maar zeer sterk licht binnen, en wanneer de deeltjes daarmede zijn aangeraakt (lichtbronnen geworden zijn), worden de stralen totaal teruggekaatst waardoor de donkere ondergrond ontstaat. De overdreven reinheid van het glaswerk is nu tevens ook verklaard, waar ieder stofje, iedere oneffenheid als „zelflichtend" lichaampje gaat fungeeren; hoe meer van deze lichtbronnetjes, hoe onvollediger de donkere ondergrond zal zijn. Begrijpelijk is het nu ook, dat er Cederolie tusschen oppervlak condensor en onderkant objectglas in moet zijn, want was er lucht, zoo zouden de stralen daar reeds, dus lang voor dat zij het object bereikt hebben, terug worden gekaatst. De Paraboloïd Condensor van Siedentopf heeft een Num. Apert van 1.1 — 1.4, m.a.w. stralenbundels van een Num. Apert van 1.1 — 1.4 worden nog in het brandpunt van den condensor gereflecteerd. De stralenbundels van een Num. Apert, van 0 — 1.1 worden door de blende A teruggekaatst. Voor het bereiken van een „volslagen" donkerveld mag de stralenkegel welke het objectief binnentreedt geen grootere Num. Apert, bezitten dan 0.8; de randstralen moeten dus worden geweerd, want gaan zij door, dan ontstaat er veel te veel licht, en is het „donkerveld" opgeheven. Voor het gebruik der Homogene-Olie Immersielens '/,2 (Num. Apert 1.3) of Apochromaat 3 ü 4 m.M. (Num. Apert 0.95) beide lenzen met zeer hooge Num. Apert, moet dus een „blende" worden aangebracht om de randstralen te weren, m.a.w. de Num. Apert te verlagen en te brengen op 0.8. Het voordeel van het gebruik der Hom. Immersielens is echter, dat er van een „dekglascorrectie" geen sprake behoeft te zijn, aangezien de laag cederolie tusschen dekglas en objectief, geen andere breking geeft, deze differentie geheel wordt opgeheven. Een te dik of te dun dekglas geeft bij gebruik van een „droog systeem" dadelijk een onduidelijk beeld; na meting der dekglas-dikte kan door den Correctiering dit euvel worden opgeheven. In den handel bestaat nog een gecombineerde Helderveld-Donkerveld Condensor waarbij de centrale blende langzaam kan worden weggeschoven, zoodat alle overgangen tusschen volslagen Helderveld en volslagen Donkerveld kunnen worden verkregen. Verder nog de KardioidCondensoren (z.g. Spiegel-condensoren) deze zijn echter moeilijker in de bewerking. Oost-Indische Inkt Praeparaat volgens Burri. Spirochaeten, Bacteriën, Bloed, Bacteriën-kapsels, enz. Het „Uitstrijk" (doode) Praeparaat. Praeparaat van Tandslijm. / Pelikan Tusche No. 541 \ a. Oost-Indische Inkt. ( Giinther & Wagner. I \ Perl Tusche. Grübler. ' Utensiliën : b. Objectglazen. C. Tandenstoker. d. Platina oogje. Techniek der Methode: 1°. Maak objectglas stofvrij en vetvrij. 2°. Breng door middel van kurkstaafje druppel O.-I. Inkt op linkerhelft van objectglas. 39. Neem met tandenstoker materiaal van tusschen de kiezen. 4°. Verdeel het zich aan tandenstoker-punt bevindende slijm, in den druppel O.-I. inkt. 5°. Strijk met tweede objectglas (korte zijde) den druppel O.-I. inkt langs het objectglas oppervlak, gelijkmatig uit op onderstaande wijze. Gebruik hiervoor desnoods objectglas met „geslepen" rand. 6°. Laat praeparaat aan de lucht drogen. 7°. Microscopisch met Cederolie bekijken. Het praeparaat moet bruin van kleur en by „doorvallend" licht nog „doorzichtig" zijn. is het praeparaat te zwart, zoo is er kans op „artefacten" door den dikken inkt. Theorie der Methode: Bacteriën en cellen blijven „uitgespaard", zij worden niet door den O.-I. inkt bedekt, nemen deze niet op. Daar zij „doorzichtig" zijn kan het licht er vrij door heen gaan, waardoor zij als „witte" lichaampjes te zien zijn. Sommige bacterie-soorten vertoonen in het centrum een zwarte stip of staafje; waarschijnlijk zijn dit O.-I. Inktdeeltjes welke in een indeuking van het protoplasma (concaviteit) ziin blijven hangen (zie fig. pag. 88 links). •v- *V Leptothrix Mond Spirochaeten. draden. (let op de grove windingen en de dikte tegenover Sp. Pallida). Voor het „tandslijm-praep." behoeft de inkt niet „steriel" te zijn. Het tandslijm is zoo rijk aan bacteriën, dat de bacteriën uit den inkt afkomstig daaraan geen schade kunnen doen. Anders is dit, waar met reinculturen en syphilitisch materiaal wordt gearbeid (zie pag. 88). Praeparaat voor Bacteriën en Lues-Spirochaeten (geen Bacteriënkapsels). Gebruik hier den „sterielen", verdunden O.-I. Inkt van pag. 89 onder a. Techniek der Methode: 1°. Maak objectglas stofvrij en vetvrij. 2°. Neem op steriele wijze, door middel van uitgegloeid oogje (desnoods geflambeerd glasstaafje) enkele oogjes sterielen, verdunden O.-I. Inkt en breng deze op linker helft van objectglas. 3°. Meng hierin, met uitgegloeid oogje, een weinig van het Bacteriënof Syphilis-materiaal (Reizserum). 4°. Strijk met tweede objectglas (korte zijde) den druppel inkt langs het objectglas oppervlak gelijkmatig uit (zie pag. 87). Gebruik hiervoor desnoods objectglas met „geslepen" rand. Theorie der Methode: Dezelfde als voor het „Praeparaat van Tandslijm (pag. 87). Waar het zoeken naar Syphilis-spirochaeten toch reeds zoo moeilijk is, verdient het zeker aanbeveling den O.-I. inkt zoo zuiver mogelijk voor te bereiden. Het verdunnen en centrifugeeren der Inkt maakt het praeparaat veel fraaier. Dit praeparaat geeft nog veel duidelijker het verschil weer tusschen Spirochaete Pallida en de andere Spirochaeten, aangezien de Spirochaeten gefixeerd zijn, het groote verschil in „winding" daardoor zoo duidelijk is te zien. Sp. Pallida met vele zeer steile, regelmatige windingen, de andere Spirochaeten met grovere, onregelmatige windingen en veel dikker dan Sp. Pallida (zie nog pag. 89). Het „levende" (natieve) Praeparaat. Praeparaat voor Bacteriën, Spirochaeten, Bacteriën-kapsels, enz. a. Oost-Indische Inkt-fAqua Dest. aa. (Pelikan Tusche No. 541 \ Günther & Wagner ) Perl Tusche Grübler ' (Indien noodig kan de inkt\ meer worden verdund 1-2, 1-3J Verdeel den verdunden O.I. inkt in centrifu.. ..... ^ geerbuizen. Sluit deze met wattenprop af. ensi ien. Steriliseer 3 X achtereenvolgens 1 uur bij 100° C. Centrifugeer ± 10 min. Druk wattenprop naar omlaag en sluit de buizen met goed sluitende Caoutchouc Kurk. Voor het gebruik niet schudden. b. Holle objectglazen. C, Dekglazen 18 m.M. □ d. Platina oogje. Gebruik steeds gesteriliseerden O.-I. inkt, daar Bacteriën zich „spontaan" in deze inkt ontwikkelen. Techniek der Methode: 1°. Maak hol objectglas en dekglas stofvrij en vetvrij. 2°. Omgeef holletje van objectglas door dunnen rand vaseline (zie pag. 61) 3°. Gloei oogje uit. 4°. Neem op steriele wijze, door middel van platina oogje, druppeltje verdunden O.-I. inkt en breng dit midden op dekglas. 5°. Meng hierin, met uitgegloeid oogje, een weinig van het Bacteriën of Syphilis materiaal (Reizserum) en wrijf het druppeltje een weinig uit, opdat de inktlaag dunner worde. 6°. Leg objectglas met hollen kant naar beneden op dekglas en draai het praeparaat om. (Hangende druppel, zie pag. 61). 7°. Bekijk microscopisch met Cederolie, stel eerst in op de grens van druppel en dekglas, en bekijk met vry sterk kunstlicht; zoek eerst maximaal licht, met Irisblende desgewenscht daarna afblenden. Theorie der Methode: Oost-Indische Inkt is bereid van „roetdeeltjes", welke in een gomoplossing zijn gesuspendeerd. Deze „kooldeeltjes" zijn zoo fijn, dat zij een „colloïdale oplossing" uitmaken. Zij hebben een sterke Brown'sche moleculair beweging. Spirochaete, Pallida » v andere ' Spirochaeten Bacterie met Kapsel Deze „kooldeeltjes" worden nu door bacteriën, spirochaeten, enz., terug gedrongen, zoodat deze niet verder gaan dan tot aan de buitenste grenzen van het cellichaam. De micro-organismen vertoonen zich als „uitgespaarde" (witte) lichamen, welke zich door de kooldeeltjes heen bewegen. Spirochaete Pallida heeft een duidelijke roteerende beweging, verliest daarbij nooit zijn „steile regelmatige windingen" (zwakke undulaties), blijft een „starre" spiraal, is uiterst fyn en dun en zeer moeilijk kleurbaar (zie Giemsa-kleuring). welke veel minder sterke en onregelmatige windingen bezitten, veranderen hare windingen bij de beweging (sterke undulaties) zij zijn dikker dan Sp. Pallida en gemakkelijker kleurbaar. Bacterie-Kapsels zijn als uitgespaarde, onduidelyk begrensde hoven om het bacterie-lichaam te zien. Voor „Kapsels" moet het praeparaat onmiddellyk worden bekeken, daar spoedig „plasmolyse" optreedt en het beeld daardoor verandert. Overige Spirochaeten Sp. Dentium „ Buccalis „ Refringens „ Balanitidis Methode tot het kleuren van Spirochaeten volgens Becker-Krantz. ') a. Alles wat voor een gewoon „uitstrijkpraeparaat" noodig is, Utensiliën: <*ie pag. 53). b. Bunsenbrander met spaarvlam -J- praeparaatverwarmer, (zie pag. 71). Vereischte Reagentia: Acid. Acet. Glaciale 1.— i Fixeervloeistof Formaline 20.— Aqua Dest. 100.— i van Ruge 10 % Acid. Tannicum 100.— \ Tannine Riïts Phenol. Liquef. (om te conserveeren) 1,— / dniiiiic jia Kleurstof: | 5 % Methylviolet in Aqua Dest 44 ccm Methylviolet Aniline-Olie 1 „ Alcohol 96 % 5 „ Techniek der Kleurmethode: 1°. Maak dun gelijkmatig uitstrijkpraeparaat (zie pag. 53) met (andenstoker materiaal van tusschen de tanden of kiezen of Luetisch materiaal met oogje of pipetje. 2°. Laat praeparaat drogen aan de lucht. 1) Deutsche Med. Woch. No. 33. 3°. Druppel op praeparaat vloeistof van Ruge .... 1 min. 1 è 2Xvernieuwen in de min. 4°. Afspoelen onder den waterstraal. 5°. Oiet Tannine-Bijts op praeparaat, en laat onder zachte verwarming (tot dampvorming) inwerken 1/2 min. Leg praeparaat daartoe op verwarmingstoestel boven op brander en werk met de spaarvlam. 6°. Afspoelen onder den waterstraal. 7°. Nakieuren met Methylviolet onder zachte verwarming (tot dampvorming) 1 a 2 min. 8°. Afspoelen onder den waterstraal. 9°- Drogen en bekijken. Spirochaeten en Bacteriën zijn donker-violet gekleurd. Theorie der Kleurmethode: Spirochaeten en voornamelijk Spirochaete Pallida zijn zeer moeilijk te kleuren. Wanneer zij zich b.v. met de Giemsa'sche kleurstof hebben laten kleuren (dit soms eerst na 24 uur), zoo is Sp. Pallida door zijn uiterste fijnheid en teerheid, dikwijls nog bijzonder slecht te zien. Door inwerking van de Tannine byts wordt allereerst een betere kleurbaarheid der Spirochaeten bereikt, in de tweede plaats worden zij „verdikt" doordat het Tannine een fijn neerslag vormt, dat het protoplasma doordringt en waarvan tevens een zeer verhoogde kleurbaarheid het gevolg is. (Zie pag. 20). Het groote voordeel dezer kleurmethode is, dat de windingen der Spirochaeten hierbij niet verloren gaan; Spir. Pallida dus door zijn steile, regelmatige korte windingen, dadelijk kan worden onderscheiden van de Spirochaeten welke grovere onregelmatiger windingen bezitten. Zweepdraden Kleuring volgens Zettnow.') Utensiliën; a' Objectglazen. Dekglazen 18 m.M. □ Kalium bichromaat 6 % ... 100 \ Zwavelzuur ... 6 % ... 100 i Kook object- en dekglazen in deze oplossing enkele malen. 10 è 15 min. Spoel in Aqua Dest. goed af. Bewaar deze daarna in stopflesschen waarin alcohol 96 %. 1) L. Heim. Lehrbuch der Bacteriologie, Stuttgart, Verlag Ferdinand Enke. b. „Hol" geslepen objectglazen. C. Vaseline. d. Platina oogje en naald. e. Steriele Physiologische Zoutsolutie (0.85 NaCl in water). f. Twee pipetten van % ccm. inhoud. Utensiliën. ^ Agarcultuur 12-24 uur oud (versch). h. Bunsenbrander -|- Praeparaatverwarmer of Microbrander. i. Cederolie (zuiver). j. Filtreerpapier. k. Petri'sche schaal. Reagentia. TannineBijts. Aethylamint Zilveroplossing. Reagentia: A. Acid. Tannicum 10 gr. oplossen in Aqua Dest 150 ccm. tot koken verhitten filtreeren en laten afkoelen. B. Tartarus Stibiatus 2 gr. in kokend Aqua Dest. oplossen 40 ccm. I Reagentia: A. Nitras Argenti 5 gr. -J- Aqua Dest 30 ccm. + Sulfas Natricus 6 gr. N <" co C/i 5T Er wordt neerslag gevormd (zilversulfaat). Wasschen van neerslag: Giet bovenstaande vloeistof af, vul bij met Aqua Dest. 20 ccm., schudden en laten bezinken, vloeistof afgieten. Bijvullen met Aqua Dest, 20 ccm., enz., enz. Deze bewerking 2 a 3 X herhalen. Eindelijk op neerslag gieten 500 ccm. Laten staan 1 uur. Overgieten in bruine stopflesch, goed sluitend. Vloeistof onbepaald houdbaar. Voorgebruikniet schudden. B. Aethylamine (NH2 C2 H5) in den handel als 33 %. Bereiding der Tannine Byts Oploss. A verwarmen tot 45« C. zooveel van B toevoegen totdat de vloeistof na eenige minuten schudden een weinig troebel blijft. Een weinig van deze vloeistof in reageerbuis gekookt, moet door koken helder worden, bij afkoeling wederom troebel worden. Voor gebruik flink schudden; met Kristal Thymol (conserveeren) zeer lang houdbaar. Zijn de ciliën toch niet op deze wijze kleurbaar, zoo moet de bijts versterkt worden b.v. Oploss. A verwarmen tot 80" C., van B zooveel toevoegen, dat na schudden de vloeistof troebel blyft. Door afkoeling wordt de bijts steeds meer troebel. l Bereiding Aethylamine Zilveroplossing. Zifversulfaat oploss. (A) 25 ccm Aqua Dest 25 „ Voeg bij deze oplossing druppelsgewijze zooveel van B (Aethylamine) toe totdat er een duidelijk bruin troebel neerslag ontstaat. Voeg nu meer van B toe totdat neerslag met schudden weder geheel verdwijnt. De vloeistof is nu helder. Voeg nu zooveel zilversulfaat (A) toe, totdat er een duidelijke big vende troebeling ontstaat. Even voor de proef bereiden. 2°/0 Osmium Zuur. Bewaren in zwarte flesch (voor licht beschutten!) l°/0 Ammonia. In den handel als 10 %. Techniek der Methode: Objectglazen mogen alleen aan de randen worden vastgehouden, nooit het glas zelve, aangezien daardoor later zilverneerslagen worden gevormd, welke het beeld zeer vertroebelen (zwarte vormsels). 1°. Maak „Hangende druppel Praeparaat" van te onderzoeken Bacterie (zie pag. 61) en wees overtuigd, dat het organisme duidelijke en krachtige eigenbeweging vertoont. Is dit niet het geval, dan moet door overentingen de bewegelijkheid worden verhoogd of een ander organisme worden gekozen. De aanvanger beginne steeds met Spirillum Volutans (grove ciliën). 2°. Neem 2 objectglazen uit alcohol en droog deze voorzichtig met linnen lapje af (geen stofjes aantrekken door wrijven). 3°. Breng op objectglas (1) met pipet 2 druppels zoutsolutie op eenigen afstand van elkaar, druppel 2 veel grooter dan druppel 1. 4°. Breng in druppel 1 met oogje een weinig bacteriën-materiaal. De druppel moet duidelijk troebel zien. Laat enkele minuten gelegenheid, dat de bacteriën rond zwemmen en daarmede de ciliën goed uitspreiden. 5°. Breng in druppel 2 enkele oogjes 2 % Osmium zuur. 6°. Gloei oogje uit. 7°. Uit druppel 1 enkele oogjes overbrengen in druppel 2. De bacteriën met uitgespreide zweepdraden worden door het osmiumzuur oogenblikkelijk gedood, voordat zij de zweepdraden intrekken of afwerpen kunnen. 8°. Van druppel 2 enkele kleine oogjes overbrengen op objectglas II; deze zoo laten of uiterst voorzichtig een weinig uitspreiden, denk aan afbreken der zweepdraden. 9°. Laten drogen aan de lucht. 10°. Fixeeren (2 X door de vlam halen). 11°. Met praeparaatzijde naar onderen, objectglas in Petri'sche schaal leggen. 12°. Giet Tannine bijts in reageerbuis, verwarm tot koken (bijts wordt helder). 13°. Schenk de kokende bijts op het objectglas in schaal, tot dit geheel bedekt is. Laten inwerken totdat de bijts weer even troebel wordt. 14°. De praeparaatzijde flink spoelen onder den waterstraal. (Verwijdering der Tannine). 15°. Op filtreerpapier praeparaat vertikaal laten uitdruipen. 16°. Leg praeparaat op verwarmingstoestel boven brander, regel de vlam laag. (Zie pag. 71) 17°. Opgieten Aethylamine-Zilveroplossing en onder dampvorming laten inwerken, totdat het praeparaat pik zwart wordt (niet roodbruin of paars, maar zwart). 18°. Zilveroplossing afgieten. 19°. Opgieten 1 °/0 Ammonia-oplossing 3 a 4 sec. Verwijdering van Zilveroxyd neerslagen. 20°. Afspoelen onder den waterstraal. 21°. Drogen tusschen filtreerpapier. 22°. Insluiten (dekglas + cederolie). (Zie pag. 55). 23°. Microscopisch bekijken. Het Bacterielichaam is pik zwart gekleurd, de zweepdraad (en) als fijne, zwarte geunduleerde draad aan het bacterielichaam hangende. Amphitrich Lophotrich Peritrich Monotrich Peritrich Theorie der Zweepdraden-kleuring. De zweepdraden (geeselharen-ciliën) zijn door hun fijnheid bij de gewone kleurmethoden niet te zien; ook zijn zij zeer moeilijk kleurbaar. Door de Tannine-Bijts ontstaat een zeer fyn neerslag 't welk het bacterieplasma en ook de zweepdraden doordringt, waardoor deze opzwellen, daardoor dikker en tevens kleurbaar worden, (zie pag. 20). De zilveroplossing is zoo bereid, dat zoodra zich reduceerende stoffen voordoen (Tannine enz.) het zilver onmiddellijk wordt neergeslagen. Bij de kleuring ontstaat dit uiterst fijne zilverneerslag in het bacterielichaam en den zweepdraad, waarin nog bijts aanwezig is, waardoor deze diepzwart worden gekleurd. Begrijpelijk is het nu, dat alles aan het glaswerk, hetwelk ook deze zilver-reductie tengevolge heeft, moet worden vermeden (stofjes, vuiltjes, vet, enz.). Het glaswerk moet dus uiterst rein en zuiver zijn. De vingers mogen alleen de randen van het objectglas aanvatten, vooral nooit het glas zelf. Het welslagen der ciliënkleuring hangt van vele factoren af, een der voornaamste is zeker, de bereiding eener goede Tannine bijts waarbij het neerslag fijn genoeg is dat het de zweepdraden geheel kan doordringen. Is de bijtsing onvoldoende geweest, dan helpt geen kleuring meer, het praeparaat moet worden overgemaakt. Bij zeer hardnekkige objecten, koke men het praeparaat met de bijts. Door de buitengewone teerheid der zweepdraden kan geen te groote voorzichtigheid bij het vervaardigen van het praeparaat worden aanbevolen. Den beginner beproeve eerst een gemakkelijk object: n.m. Spirillum Volutans vervolgens Bac. Proteus „ Vibrio Cholerae eindelijk Bac. Typhi en Coli Het gieten van Gelatine- en Agarplaten tot het aanleggen van Reinculturen. Wanneer bacteriën in of op vaste voedingsbodems worden geënt, in zoo'n zwakke concentratie (sterke verdunning), dat zij elkander in de vrije ontwikkeling niet verdringen of hinderen, zoo groeien zij uit tot een bepaalden, zelfstandigen colonievorm, niet een voor hun soort typische structuur en kleur. Door het afenten van een dergelijke zelfstandige colonie op agar-agar, wordt een „reincultuur" verkregen. a. Gewone Voedings-Gelatine of Voedings-Agar in reageerbuizen afgetapt (pl.m. TO a 15 ccm. per buis). Utensiliën: ^ 3 Steriele glasdoozen (Petri'sche schalen, doorsnede 9 cM.) c. Platina oogje. Techniek der Methode. Gelatine smeltpunt plm. 26-280 C. Agar smeltpunt 90—100" C. „ stolt langzaam onder 20o C. „ stolt vrij plotseling bij 370 C. 1°. Smelt 3 buizen (I—II—III) gelatine (in waterbad) of agar (in Papin, pot) laat deze afkoelen tot 40—45° C. (in waterbad, controleer dit met thermometer; vooral niet warmer, daar anders de bacteriën geschaad worden.) 2o. Zie voor enting pag. 4 tot punt 8. ' Ent in buis I = 1 oogje bacteriën materiaal (van vasten- of vloeibaren voedingsbodem) en meng dit met voedingsvloeistof door voorzichtig heen en weer bewegen der buis. Verd. i. II =1 oogje uit buis I en meng dit met voedingsvloeistof door voorzichtig heen en weer bewegen der buis. Verd. 2. UI = 2 oogjes(2Xl oogje) uit buisll en meng dit met voedingsvloeistof door voorzichtig heen en weer bewegen der buis. Verd. 3. 3°. Giet buis I geheel uit in steriele Petri'sche schaal T II 2 » » 11 yj n » » » » m3 » » » » >» n ** | Op de volgende wijze: Techniek van het Uitgieten: 2. Afnemen Wattenprop 4. Buis spoedig ledigen. 5. Vang langsloopenden druppel op. 7. Draaiende beweging der buis. Geheel indrukken van den wattenprop. 9. Voorzichtig heen en weer zwenken. Naam en verdunning van het materiaal. Datum van het gieten der plaat. 10. 4°. Laat de platen op vlakken, kouden ondergrond stollen (plm. 15 min.) Plaats de Agar bi/ 37° C. bodem van plaat naar boven, dus omgekeerd. „ „ Gelatine bij 240 C. deksel „ „ „ boven. Theorie der Methode: Vloeibare gelatine of agar, met steeds sterker verdund materiaal geënt. Petri'sche schalen met uitgegoten voedingsbodem. Er wordt steeds minder bacteriën-materiaal in den vloeibaar gemaakten, vasten voedingsbodem gebracht (er ontstaat dus een sterke verdunning). Door het plotseling uitgieten in schalen (sterke vergrooting van het oppervlak) worden de organismen van elkaar gerukt (gescheiden) en blijven door het stollen van den voedingsbodem op die plaats gefixeerd. Zij gaan nu uitgroeien tot een colonie, welke een voor hun soort typischen vorm, kleur en inwendige structuur vertoont Door middel van a. Vorm, uitwendige en inwendige structuur en kleur deze methode van de colonievormen der verschillende microorganismen- kan men; groepen, vaststellen. b. Het al of niet peptoniseerend vermogen der bacteriënsoorten (vervloeiing der gelatine) nagaan. c. Door het tellen der colonies, ongeveer het aantal bacteriën vaststellen, dat in een bepaalde vloeistof-hoeveelheid aanwezig is. d. Door het afenten der verschillende coloniën „Reinculturen" verkrijgen. Het onderzoek der Gelatine- en Agarplaten en het af-enten der Golonies. Het Macroscopisch onderzoek der platen: Bij voldoenden groei kan men dikwijls al macroscopisch, desnoods niet behulp eenergewone loupe den verschillenden vorm en structuur der colonies vaststellen. Bij „vervloeide" gelatine houdt men de plaat horizontaal in de hand, en bekijkt de colonies door het even oplichten van het deksel. Bij „niet" vervloeide gelatine en agarbodems houdt men de platen gesloten en vertikaal in de hand, met den boden naar zich toe en gekeerd naar het volle licht. Het „Tellen van het aantal Colonies" per plaat. Indien de Gelatine- of Agarplaat zoo vol colonies is, dat deze onmogelijk alle kunnen worden geteld, zoo zoekt men eerst een Vertikale stand der plaat. gemiddelde en berekent daarna het totale aantal voor de geheele plaat, als volgt: a. Vierkant stuk bordpapier (zwart), waarop met witten inkt of .. ..... gele verf een verdeeling van „II X'1 ruitjes van 1 cM-J" ensilien. wordt aangebracht, (totaal 121 ruitjes van 1 cM.2) zie fig. b. Loupe. Techniek der Methode: 1°. Neem van de reeks Gelatine- of Agarplaten die plaat, waar de colonies over het plaatoppervlak zoo verdeeld zijn, dat zij „telbaar" zijn, (waarschijnlijk 2de of 3e verdunning). 2°. Leg de Petri'sche schaal op het verdeelde bordpapier: (Open, wanneer deze niet meer Gesloten, met bodem naar boven \ behoeft te worden gebruikt of wan- wanneer er nog moet worden af- I neer voedingsbodem vervloeid is geënt, verder bebroed, enz. ' 3°. Tel het aantal Colonies van 10 verschillende ruitjes, desnoods met behulp eener Loupe. 4°. Bereken het gemiddelde per 1 ruitje. Voorbeeld: 10 ruitjes te samen 30 colonies 1 3 S.° Bereken nu het totaal aantal colonies van het geheele plaatoppervlak door volgende vergelijking: Straal van Petri'sche schaal (doorsnede 9 cM.) 4.5 ruitje. ÏÏR2 = yX{x| = 5= globaal 63 Het totale plaatoppervlak beslaat dus 63 ruitjes. Aantal colonies per ruitje = 3 „ „ „63 ruitjes = 3 X 63 189 colonies (totale plaat). Bij het water- en melkonderzoek, waar een juist afgemeten hoeveelheid, b.v. 'ƒ,00 ccM. in de plaat is gebracht, moet het totale colonie aantal per plaat in dit geval nog met 100 worden vermenigvuldigd, om het totale colonie-aantal per 1 ccM. water of melk vast te stellen, dus 189 X 100 18900 colonies per ccM. Voor de verdunning '/iooo °f Vioooo moet dit totale aantal met 1000 en 10000 worden vermenigvuldigd. Het Microscopisch onderzoek der Platen. Halve Lichtsterkte. Om bacteriën-coloniën te kunnen zien, werke men met „zwakke vergrooting", dus met z.g. „droog-systemen". Optische samenstelling: VoorZeiss als objectief & (A) a\s oculair No. 2 of 4 » Lcitz „ „ No. 3 „ ii „ 2 „ 4 „ Reichert „ „ ,, 3 „ ,, „ 2 „ 4 n Winkel „ „ „ 2 „ ,, „ 2 „ 4 . Vergrooting pl.m. 50 tot 100 maal Stand van de onderdeelen van het microscoop. i Dezelfde *> als op I pag. 63 1°. a. Bij „vervloeide" voedingsbodems (gelatine) plaatst men het bakje op de objecttafel zonder deksel. b. Bij „niet" vervloeide voedingsbodems (agar — gelatine, enz.) plaatst men de gesloten schaal met deksel op de objecttafel, bodem naar het objectief toegekeerd. (Omgekeerd dus) 2°. Zoek eerst maximale lichtsterkte (zie pag. 64 onder 3°) desnoods kan men de Abbè'sche Condensor eruit nemen, en sluit de Irisblende tot op de helft, zoodat er halfdonker ontstaat. 3°. Houdt de plaat met linkerhand omvat (om kleine bewegingen te kunnen maken, voor het centreeren der colonie) en draai, door oculair ziende (met rechterhand) het objectief naar omlaag, totdat zich duidelijk rond omschreven, georganiseerde lichaampjes vertoonen. Het afenten der Colonies tot het aanleggen van Reinculturen : a. Platina naald. b. Steriele agar (in reageerbuizen schuin) Utensiliën: c. Glaspotlood met fyne punt of Fijne pen en inkt. Het aanstrepen der colonies: Wanneer men bij //zacroscopisch- of /m'croscopisch onderzoek (zie boven), verschillende typen van coloniën onderscheidt, dan moeten deze op de een of andere wijze worden aangeteekend, om ze later te kunnen afenten: I. Bij „vervloeide" voedingsbodems : a. Macroscopisch onderzoek (zie pag. 98) de colonie onder het bakje door (aan bodem) aanstrepen. b. Microscopisch onderzoek (zie pag. ioo); is het aanstrepen niet mogelijk, hier moet meteen worden afgeënt. II. Bij „niet" vervloeide voedingsbodems: a. Macroscopisch onderzoek (zie pag. 98) door gewoon aanstrepen op bodem, met glaspotlood of pen en inkt. b. Microscopisch onderzoek (zie pag. ioo) terwijl men door oculair ziet, aanstrepen onder het objectief door op bodem van bakje; hiervoor het beste pen met lange punten. Het afenten der colonies: I. Bij „vervloeide" voedingsbodems-. Macroscopisch De schaal wordt geopend door het gewoon aflichten van het deksel. Met de platina naald wordt de colonie afgestoken en op agar-agar geënt, (voorzichtig met naald streep trekken over de schuine agar-oppervlakte, agar niet beschadigen). b. Microscopisch De open schaal staat op objecttafel en nu wordt, terwijl men door oculair ziet, met de platina naald de gewenschte colonie afgestoken en overgeënt. II. Bij „niet" vervloeide voedingbodems-. a. Macroscopisch = De schalen worden geopend en de coloniën afgestoken op de volgende wijze: RoHfm Gloei platina naald uit in de vlam en laat deze afkoelen. (Zie pag 4 onder 4). 3. Gebruik hier de platina naald. 4. Steek colonie voorzichtig af. 6. Ent de colonie op agar, door met de naald voorzichtig een streep te trekken over de agar-oppervlakte (zie voor enting pag. 5—7). b. Microscopisch = Plaats bakje open op objecttafel en ent af als onder I b. (Pag. 101). De op deze wijze verkregen Agar- (rein!)culturen moeten nu microscopisch op „reinheid" worden gecontroleerd. (Gram-praep. enz.) Het aanleggen van Reinculturen door enting op de „oppervlakte" der Agarplaat. {15ccm. Agar pro „gewone" 50hccm. Agar pro „groote" schaal. b. Steriele Petri'sche schalen. ■,, ..... # c. Platina oogje en Platina naald. ensi ,en • ^ Steriele Physiologische Zoutsolutie in buizen (0.85% NaCL in water). e. Schyven Filtreerpapier ± 2 cM. grooter dan plaatoppervlak, (gesteriliseerd 1 uur ÏIOOC. in Petri-schaal). ƒ. Papiniaansche Pot. Techniek der Methode. 1°. Smelt Agar op in Papiniaanschen Pot. 2°. Laat deze afkoelen totdat buis of kolfje nog net even in de hand kan worden gehouden (er komt zoodoende minder condens-water op den Agar dan wanneer deze zoo erg heet is). 3°. Giet den gesmolten agar uit in Petri'sche schalen laagje van ± k cM. dik. (zie techniek pag. 96). 4°. Laat stollen. 5°. Droog het Agar-oppervlak op onderstaande wijze. Het droogmaken van het Agar-oppervlak. Wanneer de agar in de Petri'sche schaal is gestold, zoo ontstaat er z.g. „Condenswater" op de agaroppervlakte, kleine waterdruppeltjes, welke, wanneer het materiaal op de agaroppervlakte wordt geënt, aanleiding kunnen geven tot verspreiding en door elkaar gaan der bacteriën. Deze worden dan door de „condenswater-druppeltjes" over het plaatoppervlak versleept, de coloniën welke uit deze individuen ontstaan zijn dus niet meer van elkaar „geïsoleerd", zoodat de „reincultuur" mislukt. Om dit tegen te gaan moet het „condenswater" door filtreerpapier worden geabsorbeerd, op de volgende wijze: lo. Knip schijven filtreerpapier + 2 cM. grooter dan het oppervlak der Petri'sche schaal, (plaats de schaal op enkele lagen van het papier en knip rondom af 2 cM. grooter). 20. Steriliseer deze schijven (in grootere Petri'sche schaal) 1 uur by llOo C. 30. Neem met uitgegloeid, afgekoeld pincet schijf filtreerpapier uit de schaal (even aflichten van deksel) en leg deze boven op het „bakje" der agarplaat. 40. Bedek de schaal onmiddellijk door het deksel en druk dit naar beneden over den rand van het bakje, het filtreerpapier zal zich dadelijk in den rand voegen. 50. Draai de Petri'sche schaal om (bodem naar boven) en plaats de schaal enkele uren bij 370 C. Indien het condenswater niet spoedig genoeg door het filtreerpapier wordt geabsorbeerd, zoo kan men het drogen bespoedigen, door de plaat een weinig te openen, door tusschen rand van deksel en bakje een omgebogen lucifer te steken, waarop het deksel kan rusten. Endo-platen (Typhus) en Loeffler's serumplaten (Diphtherie) zijn vanzelf reeds droog genoeg om dadelijk geënt te kunnen worden. Het enten der plaat. Qebruik uitsluitend platen met „droog" oppervlak. 1°. Giet zooveel zoutsolutie uit reageerbuis, dat er + 1 ccM. overblijft. 2°. Breng hierin zeer weinig (punt van naald) van het Bacteriënmengsel (Agar-cuituur enz.) en wrijf dit goed fijn, langs wand van buis even boven den vloeistofspiegel, en meng van lieverlede met de zoutsolutie. Is het bacteriënmengsel in vloeibaren toestand aanwezig (bouilloncultuur, water enz.) zoo brengt men hiervan 1 oogje in de ccM. zoutsolutie. 3°. Schudt de zoutsolutie + bacteriën goed heen en weer, om de aan elkaar klevende bacteriën mechanisch nog eenigszins van elkaar te rukken. 4°. Buig oogje om met pincet en gloei dit uit. Zorg vooral dat „oogje' rondom gaat is; druk oogje met pincet goed plat; uitstekende oneffenheden beschadigen den voedingsbodem. 5°. Neem nu 1 oogje uit het zoutsolutie-bacteriënmengsel en strijk dit streepsgewijze over het oppervlak der agarplaat uit, zooveel strepen naast elkaar, als het plaatoppervlak groot is, met kleine tusschenruimte. (Zie techniek der enting pag. 9). 6°. Plaats de agarplaat met bodem naar boven in broedstoof 37° C. Na ± 24 uur zullen op de laatste strepen, geïsoleerde colonies gegroeid zijn. Is dit niet het geval, zoo is het materiaal te bacteriën-rijk geweest; overdoen door materiaal meer te verdunnen of over meerdere platen uit te strijken. Van de duidelijk „geïsoleerd" liggende colonies afenten op agar (zie pag. 100—101) 24 uur bij 37° C. en vervolgens microscopisch bekijken of deze cultuur inderdaad rein is (Gram, enz.) Theorie der Methode. Door steeds met het zelfde oogje over het vrij groote oppervlak streepsgewijze te strijken, zullen naarmate de laatste streep is bereikt, zoo weinig bacteriën meer aan het oogje zijn achtergebleven, dat deze geïsoleerd van elkaar zich tot colonie kunnen ontwikkelen. Ent men nu een dergelijke op zich zelf staande colonie af op agar, zoo is de kans zeer groot met een „reincultuur" te doen te hebben. Deze methode tot verkrijging eener reincultuur verdringt echter niet het „gieten" van Gelatine of Agarplaten" (zie pag. 95). Mislukt op deze wijze de reincultuur, zoo zal men steeds zijn toevlucht tot het „gieten der platen" moeten nemen. Quantitatief Bacteriologisch Water-Onderzoek. (Grachtwater, Vechtwater, Duinwater, enz. enz.) 1°. Aantal Bacteriën (coloniën) vaststellen pro ccM. water. Doel • 2°' Aantoonen van Bacteriën welke op „faecale" verontreiniging van het water wijzen. (Bact. Coli). 3°. Aantoonen van Pathogene Bacteriën. Het „opvangen" van het water in het Receptaculum. Men zij voorzichtig met het opzenden van water naar het Laboratorium. In den zomer kan een tijdsverloop van eenige uren het Bacterie-aantal sterk doen stijgen. Men onderzoeke zooveel mogelijk op de plaats zelve, en giete de platen zoo spoedig mogelijk, nadat het water is opgevangen. Voor het „quantitatieve" Bacteriologische water-onderzoek is het een hoofdvereischte, dat in het te onderzoeken watermonster van buiten af geen bacteriën meer kunnen binnentreden, welke het werkelijke bacteriegehalte verkeerd zouden voorstellen. Evenmin moeten in het Receptaculum omstandigheden aanwezig zijn, welke dit „natuurlijke kiemgehalte" eenigermate positief of negatief zouden beïnvloeden. (Zonlicht, Desinfectantia, Broedtemperatuur). Het watermonster moet dus worden opgevangen in steriel glaswerk. a. Thermos-flesch met „losse" Inlegflesch (het water blijft koel) „inleg-flesch" met wattenprop steriliseeren, kurk in filtreerpapier apart er naast utensihen: of Stopflesch + 200 ccM. inhoud (bruin glas). Steriel, 1 uur bij 1100 c. b. Bunsenbrander of Spirituslamp voor „Kraan" monding. Schilders-verflamp voor afbranden „Pomp" monding. Moet het water uit de „waterleiding of pomp" worden opgevangen, zoo ga nien als volgt te werk: 1°. Flambeer de monding der kraan. (Goed met vlam afbranden.) 2°. Laat het water ± 10 min. loopen. (Verwijderen van het water dat in kraan en leiding eenigen tijd heeft gestagneerd). 3°. Open de steriele Thermos-flesch, of Stopflesch, laat het water er vrij inloopen (raak vooral niets aan) en sluit de flesch opnieuw. (Thermos-flesch door „steriele'' kurk, Stopflesch door stop.) Voor het opvangen van water uit putten of bronnen draagt men zorg geen aarde, zand of onreinheden in het Receptaculum te brengen, noch met de hand iets anders dan den buitenkant der flesch aan te raken. Voor het opvangen van water op groote diepten, zie men de specialistische handboeken. Het „Gieten der Gelatineplaten" voor het vaststellen van het kiemgehalte pro ccM. water. De water-verdunningen. Het te onderzoeken water moet zoo sterk worden verdund, dat de gelatineplaat daarvan gegoten, de „bacterie-coloniën" (waaronder vele „vervioeienden"), zoo geïsoleerd van elkaar te zien geven, dat deze gemakkelijk en zonder moeite kunnen worden geteld. De verdunningen worden gericht naar het normale gemiddelde kiemgehalte van het te onderzoeken water b.v. Grachtwater (zeer hoog Bacterie-gehalte) zal veel meer moeten worden verdund dan Duinwater (zeer laag Bacterie-gehalte) Vechtwater (gemiddeld Bacterie-gehalte) staat tusschen deze beide uitersten in. De watermonsters worden nu als volgt verdund: Gracht- of Slootwater !/,00, l/1000, '/10000 ccM. Vechtwater - y2, '/4, Duinwater — ¥1 „ Techniek der verdunningen van Gracht- of Slootwater. (Vl00> '/1000) 1 /10000 ccM.) a. Monster te onderzoeken water. b. 4 buizen met 9 ccM. steriel water. Utensiliën* c' 3 sterie,e Petri'sche schalen (doorsnede 9 cM.) d. 5 steriele Pipetten a 1 ccM. €. 3—5 buizen Gelatine (10 è 15 ccM. per buis). ƒ. Waterbad ± 40—45« C. 1°. Smelt de gelatine in waterbad en zorg dat de temp. der gelatine 40—450 C. niet overschrijdt (beschadiging der Bacteriën.) 2°. Plaats de 4 buizen met steriel water in ent-statief onder elkaar (schuin.) Schema der verdunningen: Zie voor het gebruik der „Steriele" pipet eerst pag. 10—12. 3°. Breng met steriele Pipet 1 4°. Breng met steriele Pipet 2 5°. Breng met steriele Pipet 3 6°. Breng met steriele Pipet 4 7°. Breng met steriele I Pipet 5 1 ccM. van Watermonster in Buis I Verd. '/]0 1 ccM. uit Buis I in Buis II ) Verd. 7100 J 1 ccM. uit Buis II in Petri-schaal 1 Verd. '/.oo 1 ccM. uit Buis II in Buis III Verd. 7,000 1 ccM. uit Buis III in Petri-schaal 2 Verd. 7,ooo 1 ccM. uit Buis III in Buis IV Verd. 7ïoooo 1 ccM. uit Buis IV in Petri-schaal 3 } Verd. 7ioooo J Meng door heen en weer bewegen der buis en plaats buis wederom in statief. > idem idem idem > idem 8°. Neem de gesmolten Gelatine uit waterbad. 9°. Giet in iedere Petri-schaal (1-2-3) één buis gelatine uit, meng goed en laat stollen. (Zie pag. 96). 10°. Plaats de gelatineplaten in broedstoof 24° C., deksel naar boven. Techniek der verdunningen van Vechtwater. (H- 74 ccM.) a. Monster te onderzoeken water. b. Steriele Pipet a ccM. en K ccM. Utensiliën: C. 2 steriele Petri'sche schalen (doorsnede 9 cM.) d. 2 a 3 buizen Gelatine (10 a 15 ccM. per buis). e. Waterbad + 40—450 C. 1°. Smelt gelatine in waterbad en zorg dat de temperatuur der gelatine 40—450 C. niet overschrijdt (beschadiging der Bacteriën). Schema der verdunningen. J4ccm }iccm Zie voor pipettechniek pag. 11 2°. Neem met steriele pipet Yi ccM. uit watermonster en laat direct uitvloeien in Petrïsche schaal I. 3°. Neem met steriele pipet '/4 ccM. uit watermonster en Iaat direct uitvloeien in Petrische schaal 2. 4°. Neem de gesmolten gelatine uit waterbad. 5°. Giet in iedere Petri'sche schaal (1-2) één buis gelatine uit, meng goed en laat stollen (zie techniek pag. 96). 6°. Plaats de gelatineplaten in broedstoof 24° C., deksel naar boven. Techniek der verdunningen van Duinwater. (1 - X ccM.) a. Monster te onderzoeken water. b. Steriele Pipet a 1 ccM. en X ccM. utensiliën: c. 2 steriele Petri'sche schalen (doorsnede 9 cM.) d. 2 a 3 buizen gelatine (10 a 15 ccM. per buis). e. Waterbad 40—45» C. 1°. Smelt gelatine in waterbad en zorg dat de temperatuur der gelatine 40—45° C. niet overschrijdt (beschadiging der Bacteriën). Schema der verdunningen: 1 ccm Jiccm Zie voor pipettechniek pag. 11 2°. Neem met steriele Pipet 1 ccM. uit watermonster en laat direct uitvloeien in Petri'sche schaal 1. 3°. Neem met steriele Pipet 1/2 ccM. uit watermonster en laat direct uitvloeien in Petrüsche schaal 2. 4°. Neem de gesmolten gelatine uit waterbad. 5°. Giet in iedere Petri'sche schaal (1-2) één buis gelatine uit, meng goed en laat stollen (zie techniek pag. 96). 6°. Plaats de gelatineplaten in broedstoof 24° C. deksel naar boven. Het Onderzoek der Water-Gelatineplaten. De „ Water-Gelatineplaten" (zij blijven al dien tijd in broedstoof staan) worden na 48 uur onderzocht en vervolgens nog eens na 3—5 dagen, als volgt: 1°. Tellen der Coloniën per ccM. water (zie pag. 99). 2°. Vaststellen van aantal vervloeiende (rottingsbacteriën) tegenover niet vervloeiende Coloniën. 3°. Bepaling der Bacteriën-soorten door het maken van uitstrijkpraeparaten (Oramkieuring pag. 56) en het aanleggen van Reinculturen (pag. 98-102). In de meeste gevallen dient het Quantitatieve Bacteriologische wateronderzoek om vast te stellen of het water als „drinkwater" geschikt is. Het Bacteriën-gehalte van water wordt door het Jaargetijde beïnvloed, (Zomermaanden hooger, Wintermaanden lager), toch mogen de schommelingen niet te heftig zijn. Door langdurige en achtereenvolgende wekelijksche onderzoekingen onder volkomen gelijkwaardige omstandigheden (constante gelatine, gelijke verdunningen, constante temp., onderzoek na gelijk aantal dagen) wordt een juist overzicht verkregen van deze „gemiddelden per maand", zoodat plotselinge sterke stijgingen in het Bacteriën-aantal kunnen worden vastgesteld en de oorzaak daarvan moet worden opgespoord (verstopping van filter, ondeugdelijkheid van filter, enz.) Het is moeilijk om eenigermate een „grensgetal" van het Bacteriënaantal voor water aan te geven, dit moet voor ieder water afzonderlijk worden vastgesteld. Robert Koch gaf als maximum 100 col. per ccM. water op. f*ndpx 1 50 co|onjën per ccM — Kiem-arm water. Ahmentanus 5Q0 = Kiem_rijk water. voor Water ) De watersoorten te Amsterdam verhouden zich als volgt: ') ^ x , o x •« ** \ voor drinkwater Grachtwater = oneindig aantal Bacterien per ccM. j onbruikbaar V^Chtw£5ler — zomermaanden gemiddeld 44 col. per ccM. kanaalwater) ~~ wintermaanden „ 20 col. per ccM. 1) Gegevens ontleend aan Verslag Oemeent. Gezondheidsdienst 1918. Duinwater (Prise d'Eau) | Voge- Duinen'enzang | Zand| voort Bronwater (Price d'Eau) Laren Watert. Amstel zomermaanden 19 col. per ccM. wintermaanden 11 col. per ccM. zomermaanden 4 col. per ccM. wintermaanden 6 col. per ccM. drinkwater i | drinkwater Met nadruk moet er op worden gewezen dat het „Quantitatieve Bacteriologische water onderzoek" nooit op zichzelf alleen mag staan, steeds de coli-gistingsproef volgens Eykman (zie onder) en het „onderzoek van den watervang" daarmede samen moet gaan. Het kan toch zeer goed mogelijk zijn dat het „quantitatieve" onderzoek volkomen bevredigend is, het water echter door pathogene bacteriën uitermate gevaarlijk is (Faecale verontreiniging) Ziepag. 112. Theorie der Methode van onderzoek. Het principe van het „gieten der Gelatineplaten" door middel der verdunningsmethode is hetzelfde als op pag. 95. Er is echter in de technische uitvoering van het gieten der Gelatineplaten tot het aanleggen van Reinculturen (A) en die voor het Water- en Melkonderzoek (B) eenig verschil. Bij A wordt het Bacteriënhoudend materiaal dadelijk in de gelatine gebracht, en het geheel in de schaal uitgegoten, bij B wordt het Bacteriënhoudend materiaal eerst afzonderlijk in de schaal gebracht daarna eerst de Gelatine daarop gegoten. De oorzaak hiervan is dat A een qualitatieve en B een quantitatieve methode is. Blijft er bij het uitgieten bij A Gelatine in de buis achter, dan doet dit er niets toe, aangezien niet zoo zeer het aantal der Bacteriën, als de „soorten" van belang zijn. Bij B is dit echter anders, daar is de quantiteit van groot belang, aangezien het Bacteriënaantal per ccM. moet worden vastgesteld, hier dus de juist afgepaste hoeveelheid in de plaat aanwezig moet zyn. De Gelatine dient zuiver als voedingsmateriaal en om den geïsoleerden groei der Bacteriën totcoloniön te bewerken; of erGelatine in de buis achter blijft doet aan de quantiteit van het water niets meer af. De Coli-Gistings-Proef voor Water volgens Eykman. (Aantoonen van Faecale verontreiniging van Drinkwater). Eykman's vloeistof Water 100 Pepton 10 j NACL 5 Glycose 10 Reactie zwak Alkalisch || (lakmoes, vooral niet zuur) Steriliseeren 3U uur bij 1100 C. Filtreeren. Toevoegen 10 gr. Glycose Oplossen. Aftappen in steriele buizen ieder 5 ccM Steriliseeren 2 dagen achtereen 15 min. bij 1000 C. (vooral niet hooger, anders verandert de glycose). a. Monster te onderzoeken water (zie over opvangen pag. 104). Utensiliën* ^^ Gasbuizen (welke zoo gemaakt zijn, dat het gesloten been tot aan de knie-ombuiging 40 ccM. inhoud heeft. 1) C. Broedstoof van 460 C. en broedstoof van 370 C. 1) Verkrijgbaar bij firma Marius te Utrecht. Techniek der Methode: 1°. Schenk in iedere gasbuis 5 ccM. Eykman's vloeistof (na deugdelijk flambeeren van den buishals). 2°. Giet in elk der 4 gasbuizen 40 ccM. (4 X 40 = 160 ccM.) van het te onderzoeken water. 3°. Meng, door heen en weer laten loopen der vloeistof (kantelen der gasbuis). 4°. Drijf de luchtbellen uit, door steeds de vloeistof naar het gesloten been der gasbuis te drijven. Zorg vooral dat er geen enkele gasbel boven aan het gesloten einde der gasbuis te zien is. 5°. Plaats 2 gasbuizen bij 46° C. "1 (Zorg dat de temperatuur ? 2 „ „ 37° C. ƒ vooral niet hooger wordt). Na 2 X 24 uur aflezen der Reactie: Bij duidelijk positieve reactie „II" is aan het gesloten been der gasbuis een duidelijke gasbel te zien, de vloeistof is door de bacteriën-ontwikkeling duidelijk getroebeld. Indien het water zeer veel lucht bevat, zoo kan het zich voordoen, dat door de hooge temp. (460 C) deze lucht zich sterk uitzet; aangezien in het gesloten been van Eykman's buis een vacuum is ontstaan, zal deze normale waterlucht zich als gasbel aan het gesloten been verzamelen, en zoodoende een z.g. „valsche" gasbel ontstaan. Moeilijkheid voor het aflezen der reactie geven deze „valsche" gasbellen niet, daar zij veel kleiner zijn dan de echte gasbel, de vloeistof zelve ook meestal niet troebel ziet. Bij de „echte" gasbel ziet men meestal aan de grens der bel en van de vloeistof, aan den vloeistofrand dus, kleine gasbelletjes, welke steeds uit de vloeistof naar boven stijgen. Twijfelt men echter toch, zoo kan men een gas-analyse doen (Resorbtie van C02 door KOH). Theorie van Eykman's Gistingsproef. Het is van buitengewoon groot gewicht na te gaan, of het „drinkwater" besmet is met ziekte verwekkende Bacteriën. Van de infectieziekten welke door drinkwater worden verspreidt, is de Typhus abdominalis wel een der voornaamste en het aantoonen eener eventueele Typhus besmetting (Faecaliën) van het water behoort tot een der belangrijkste opdrachten van den Hygiënist-Bacterioloog. Het kweeken van Typhusbacteriën uit water is buitengewoon moeilijk, zoo niet onmogelijk. Negatieve resultaten met de^ daarvoor opgegeven kweek- en aankweekingsmethoden, bewyzen niets. Het opsporen van Bact. Coli (constante faeces-bewoner) wordt nu als Indicator gebruikt om een faecale verontreiniging van het water aan te toonen. Zijn er faeces in het water gekomen, zoo bestaat er tevens kans dat er met die faeces Typhusbacillen in het water zijn geraakt (van Typhusbacillen-dragers). De veel resistentere en daardoor ook gemakkelijker aantoonbare Coli-bacillen worden dus indirect als Typhus-indicator gebruikt. Bact. Coli heeft de eigenschap Glycose te vergisten tot C02 en H. In de Faeces komen naast Bact, Coli nog een groot aantal andere glycosevergisters voor. Bact. Coli en nog enkele andere Glycosevergisters hebben de eigenschap Glycose te kunnen vergisten bij een veel hooger temperatuur, n.m. 460 Cj daartegenover staat een groote groep Bacteriën welke dit alleen bij 370 C. kunnen doen. Te onderscheiden dus: Thermotolerante Glycose-vergisters (o.a. B.-Coli) 460 C. Thermointolerante „ „ 370 C. Het is nu gebleken dat Bact. Coli versch uit den zoogdieren-darm afkomstig (Faeces) glycose vergist bij 460 C. en bij 370 C. Bact. Coli eenigen tyd geleden in het water gedeponeerd alleen glycose vergist bij 370 C. Hoe langer dus de tijd tusschen de besmetting van het water met Faeces en de Coli-proef, des te geringer de kans om Thermo-tolerante Glycose-vergisters te vinden, hoe korter de tijd, hoe meer kans. Het ligt nu voor de hand, dat hoe verscher een besmetting van het water met Faeces is, hoe levenskrachtiger ook eventueele Typhusbacillen zullen zijn, hoe ernstiger ook de kans op een Typhusinfectie wordt; hoe langer geleden een dergelijke besmetting is, hoe meer Typhusbacillen er door de protozoën zyn vernietigd, hoe geringer de kans van een Typhusbesmetting. Het terugloopen van de Glycose-vergistingslyn by 46° C. naarmate de Faecesbesmetting langer is geleden, is een duidelijk bewijs dat zich omstandigheden hebben voorgedaan, welke haar invloed op de Flora hebben uitgeoefend, waardoor de besmettingskansen zijn verminderd. Hiertoe werken voornamelijk 2 Factoren mede: 10. Invloed van het licht. 2°. Werking der Protozoën. (Zelfreiniging van het water; Bacteriën worden door de Protozoën opgegeten). Aangenomen wordt nu, dat indien er een positieve Eykman van het water bij 46" C. optreedt, de aandacht aan een faeces-besmettïng moet worden gewijd (oppervlakte water enz.). Is de Eykmanproef bij 46° C. negatief, zoo zal de tegelijk aangestelde proef bij 370 c. uitmaken of de besmetting met Faeces lang geleden heeft plaats gehad (positief bij 370 C.) of dat deze in 't geheel niet heeft plaats gehad (negatief bij 370) m.a.w. Watermonster ^ • \ • 1 ^Eykman-proef (± 100 ccM. water) -f- bij 460 C. [ • » » . t B 370 , » „ „ „ — „ 460 „ » » » # „ + „ 370 w » * * — „ 46" „ „ * n „ — „ 370 w "j Faeces-besmetting > kort geleden J (water verdacht) l Faeces-besmetting ƒ lang geleden. "j Geen > Faeces-besmetting J (water onverdacht) Dikwijls wordt van een „positieve Eykman-proef" uitgestreken op èen Endopiaat, om na te gaan of het inderdaad Coli-bacillen zijn welke de vergisting der glycose hebben teweeggebracht (Roode coloniën). Dit zal nu in vele gevallen wel zoo zijn, in andere gevallen weer niet, n.m. andere bacteriën kunnen ook „Thermo-tolerante" glycose-vergisters zijn. Voor de praktijk doet dit echter niets ter zake, aangezien vele proeven in binnen- en buitenland hebben bewezen dat: Positieve Eykman-proef by 46° C. steeds is van water van „verdachten" oorsprong. Negatieve Eykman-proef bij 46° C. steeds is van water van „onverdachten" oorsprong. Voor het aantoonen van Cholera-vibrionen in water, hetgeen wel iets gemakkelijker is dan van Typhus-bacillen, moet naar de specieele handboeken worden verwezen. Met nadruk moet worden betoogd dat noch het Bacteriologisch wateronderzoek alleen, noch het Chemisch wateronderzoek alleen (schadelijke chemische bestanddeelen: Chloor-, Lood-, Ammoniak, Nitriet) recht van bestaan hebben. Water kan Chemisch zeer schadelik, Bacteriologisch echter volmaakt goed zyn en omgekeerd. Hier geldt dus dat alleen de gelijktijdig toegepaste methoden, gegevens kunnen geven waaruit conclusies omtrent deugdelijkheid of ondeugdelgkheid van het „drinkwater" mogen worden getrokken. Quantitatief Bacteriologisch Melkonderzoek. (Rauwe melk, Laag gepast, melk, Hoog gepast, melk, Gester. melk). 1°. Aantal Bacterien (colottiën) vaststellen pro ccM. melk. . 2°. Aantoonen van Bacteriën welke op „Faecale" verontoe ' reiniging van de melk wijzen (Bact. Coli). 3°. Aantoonen of de melk Gepasteuriseerd is of t/iet. Vaten waarin de melk ter onderzoek komt. Ook voor melk zij men voorzichtig met het opzenden naar het Laboratorium; een tijdsverloop van meerdere uren kan in den zomer zeer sterk het bacteriën-aantal doen stijgen. Zooveel mogelijk dadelijk onderzoeken op de plaats zelve; men giete de platen zoo spoedig mogelijk. Rauwe melk: De monsters rauwe melk welke bij de melkslijters worden gehaald, moeten worden opgevangen in vaatwerk dat strikt genomen niet steriel behoeft te zijn, maar waarin toch in geen enkel opzicht Bact.-Coli mag voorkomen. Men zorge er dus voor dat de melk nooit met de handen in aanraking komt; om absoluut zeker te zijn, steriliseert men het vaatwerk. Ook hier is een steriele Thermos-flesch (met „losse" iniegfiesch, ziepag. 104) op zijn plaats. De melk behoudt hierin haar temperatuur. Gepast, melk: Deze melk komt steeds in goed gesloten flesschen in „Ziektekiem-vrij" den handel. Men onderzoekt steeds een niet geopende en Gester. melk: flesch. „Bacteriën-vrij" Het „Gieten der Gelatineplaten" voor het vaststellen van het kiemgehalte pro ccM. melk. De melk-verdunningeri. Ook voor melk moeten bepaalde verdunningen worden getroffen, welke het mogelijk maken dat gelatineplaten daarvan gegoten, de Bacteriën-coloniën geïsoleerd van elkaar te zien geven, opdat deze gemakkelijk kunnen worden geteld. De verdunningen worden gericht naar het normale gemiddelde kiemgehalte van de te onderzoeken melk b.v. (zeer hoogt gehalte ' ^ verdunnen Vioo, Viooo, '/loooo ccM. (% uur bijv 60-650 c weinig „ 1/2. 7io> '/ioo » verwarmd^ (H uur bij> 75-80» c weinig „ ys, >/I0, '/100 „ verwarmdj /bij 1000 C.\ Gesteril. melk of hooger /—2 ccM. of geheele flesch tegelijk bewerken. Verwarmd' Techniek der verdunningen voor Rauwe Melk. (Vl00> V1000) '/10000 CCM.) a. Monster te onderzoeken Melk, b. 4 Buizen met 9 ccM. sterïel water. Utensiliën* c' 3 sterie,e Petri'sche schalen (doorsnede 9 cM.) d. 5 steriele Pipetten è 1 ccM. e. 3—5 buizen Gelatine (10 a 15 ccM. per buis) f. Waterbad + 40 a 45° C. 1°. Smelt de gelatine in waterbad en zorg dat de temp. der gelatine 40-45° C. niet overschrijdt (beschadiging der Bacteriën). 2". Plaats de 4 buizen met steriel water in ent-statief onder elkaar (schuin). Schema der verdunningen. Zie voor het gebruik der „steriele" pipet eerst pag. 10—12. 3°. Breng met steriele Pipet I (Zie techniek pag. 11) 1 ccM. van Melk-monster in Buis I verd. Meng door heen en weer bewegen der buis en plaats buis wederom in statief 4°. Breng met steriele Pipet 2 1 ccM. uit Buis I in Buis II verd. '/ioo idem 5°. Breng met steriele Pipet 3 1 ccM. uit Buis II in Petri-schaal I verd. '/,oo 1 ccM. uit Buis II in Buis III verd. 7,000 idem 6°. Breng met steriele Pipet 4 1 ccM. uit Buis III in Petri-schaal 2 verd. 7,ooo 1 ccM. uit Buis III in Buis IV verd. 7ioooo idem 7°. Breng met steriele Pipet 5 I ccM. uit Buis IV in Petri-schaal 3 j verd. 7,0000 I idem 8°. Neem de gesmolten Gelatine uit waterbad. 9°. Giet in iedere Petri-schaal (1-2-3) één buis gelatine uit, meng goed en laat stollen (zie techniek pag. 96). 10°. Plaats de Gelatineplaten in broedstoof 24° C. deksel naar boven. Techniek der verdunningen van Laag- en Hoog- gepasteuriseerde Melk. Ö4> '/io> '/ioo ccM") Cl. Monster te onderzoeken Melk. b. 2 buizen met 9 ccM. steriel water. •|.M C. 3 steriele Pipetten a 1 ccM. en 1 a K ccM. UtenSllien: ^ 3 ster|e|e Petri'sche schalen (doorsnede 9 cM.) e. 3—5 buizen Gelatine (10 a 15 ccM. per buis), f% Waterbad + 40 a 45ft C. 1°. Smelt de Gelatine in waterbad en zorg dat de temp. der gelatine 40 450 C. niet overschrijdt (beschadiging der Bacteriën). 2°. Plaats de 2 buizen met steriel water in ent-statief onder elkaar (schuin). Schema der verdunningen. 3°. Open de melkflesch en flambeer de monding (in vlam). 4U. Neem met steriele Pipet 14 ccM. uit melkflesch en laat direct uitvloeien in Petri'sche schaal 1. 5°. Breng met steriele Pipet I (Zie techniek pag. 11) 6°. Breng met steriele Pipet 2 7". Breng met steriele Pipet 3 1 ccM. uit Melk-flescli in Buis I 1 ccM. uit Buis I in Petri-schaal 2 verd. 1 ccM. uit Buis I in Buis II verd. '/ioo 1 ccM. uit Buis II in Petri-schaal 3 \ verd. '/joo j Meng door heen en weer bewegen derbuis en plaats buis wederom in statief idem idem 8°. Neem de gesmolten Gelatine uit waterbad. 9°. Giet in iedere Petri-schaal (1-2-3) één buis gelatine uit, meng goed en laat stollen (zie techniek pag. 96). 10°. Plaats de Gelatineplaten in broedstoof 24° C. deksel naar boven. Techniek der verdunningen van Gesteriliseerde Melk. (1—2 ccM. en „geheele" Flesch). a. Monster te onderzoeken Melk. b. 2 steriele Pipetten a 1 ccM. Utensiliën: C. 2 steriele Petri'sche schalen (doorsnede 9 cM.) d. 2—4 buizen Gelatine (10 a 15 ccM. per buis) e. Waterbad + 40 d 45" C. 1°- Smelt de Gelatine in waterbad en zorg dat de temp. der gelatine 40—450 C. niet overschrijdt (beschadiging der Bacteriën). 2°. Open de melkflesch en flambeer de monding (in vlam). 3°. Breng met steriele Pipet 1 (Zie techniek pag. 11) 1 ccM. uit Melk-flesch in Petri-schaal 1 4°. Breng met steriele Pipet 2 1 ccM. uit Melk-flesch in Petri-schaal 2 5°. Neem de gesmolten Gelatine uit waterbad. 6°. Giet in iedere Petri-schaal (1—2) één buis gelatine uit, meng goed en laat stollen (zie techniek pag. 96). 7°. Plaats de Gelatineplaten in broedstoof 24° C. deksel naar boven. Ten overvloede kan men nog een geheele, gesloten flesch bij 240 C. gedurende 7 dagen plaatsen. Bij goed gesteriliseerde melk mag „geen" bacterie-ontwikkeling plaats vinden (Controleer dit door uit melk op Agar te enten). Het onderzoek der Melk-Gelatineplaten. De Melk-Gelatineplaten (zij blijven al dien tijd in broedstoof staan) worden na 48 uur onderzocht en vervolgens nog na 3-7 dagen, als volgt: 1°. Tellen der Coloniën per ccM. melk (zie pag. 99). 2°. Vaststellen van aantal vervloeiende tegenover niet vervloeiende Coloniën. 3°. Bepaling der Bacteriën-soorten door het maken van uitstrijkpraeparaten (Gram, enz.) en het aanleggen van Reinculturen (zie pag. 98-102). Bij Rauwe Melk zijn de bacteriën afkomstig van de uitmondingen van de melkgangen van de koe, uit de faeces der koe (Bact. Coli), uit de vaten waarin de melk wordt opgevangen, van de handen der melkers, uit de lucht, enz. Dit zijn meest „saprophytische" bacteriën (Meikzuurbact., Boterzuurbact. enz.) Staat de melk op geen koele plaats, dus bij verhoogde temp., daarbij in aanmerking genomen, dat de melk als zoodanig een uitnemende Bacteriën-voedingsbodem is (in tegenstelling met water), zoo zullen de bacteriën zich sterk gaan vermeerderen en de melk spoedig doen bederven (verzuren enz.). Uit een zeer hoog Bacteriën-gehalte kan dus ongeveer de ouderdom der melk (lang staan) worden vastgesteld. Codex Alimentarius voor Melk | Gemiddeld aantal Bacteriën voor ; _ .... minder dan | Rauwe e ƒ Millioen per ccM. ) Bij Gepasteuriseerde Melk mogen alleen sporendragende organismen op de plaat zijn overgebleven (Vegetatieve vormen alle gedood), pas hier eventueel de sporenkleuring toe (zie pag. 68). Door de verwarming zijn een groot aantal Bacteriën gedood (vegetatieve vormen, Typhus, Tuberculose, Diphtherie enz.) zoodat hier een veel lager gemiddelde is; de overblijvende bacteriën moeten sporendragende bacteriën zijn (Boterzuurbact. enz.) Codex Aiimentarius 1 Gemiddeld aantal Bacteriën voor voor Melk ƒ Gepasteuriseerde Melk = + 25.000 per ccM. Hoe zindelyker de melk behandeld wordt, hoe geringer het aantal Bacteriën, des te geringer ook het aantal coloniën op de gelatineplaat, wanneer deze melk is gepasteuriseerd geworden. Bij Gesteriliseerde Melk zijn zoowel de sporendragende bacteriën als vegetatieve vormen gedood. Deze melk bevat geen levend organisme meer. Toelaatbaar is echter een „reincultuur"van een niet pathogenen zeer resistenten sporendrager (b.v. Bac. Mesentericus Vulgatus). Evenals voor het „water" geldt het ook voor de „melk"; noch het Bacteriologisch melkonderzoek alleen, noch het Chemisch onderzoek alleen (vetgehalte enz.) mogen uitsluitsel geven omtrent de deugdelijkheid der melk; alleen uit een combinatie van gegevens mogen de conclusies worden getrokken. Theorie der Methode van Onderzoek. Dezelfde als voor het „Water-onderzoek" (zie pag. 109). Coli aankweekingsproef voor Melk volgens Ringeling. (Aantoonen of de melk „voldoende" is gepasteuriseerd). Ringeling's | vloeistof: I Zure voedings-bouillon | (gewone, niet alkalisch ( gemaakte Bouillon) ] 50 ccM. in kolfje, steriliseeren 1 uur bij 110» C. a. Monster te onderzoeken Melk. Utensiliën: b• Steriele Pipet i 5 ccM. C. Endo-plaat. d. Platina-oogje. Techniek der Methode: 1°. Doe in kolfje van 50 ccM. zure bouillon 5 ccM. van de te onderzoeken melk (met pipet) (zie techniek pag. 11). 2°. Meng goed en plaats 24 uur in broedstoof 37° C. 3°. Na de 24 uur in broeöstoof, worden van de zure bouillon eenige oogjes op Endo-plaat uitgestreken (zie pag. Q), daarna plaat 24 uur bij 37° C. Bij duidelijk roode coloniën (met Fuchsine-gians) is Coli aanwezig (melk niet voldoende gepasteuriseerd). Bij witte coloniën is men nooit zeker toch met Coli te doen te hebben; er zijn Coli-soorten welke soms wit op Endo kunnen groeien (Para-Coli). Bac. Proteus kan het ook zijn. In ieder geval mogen bij goed gepasteuriseerde melk niet anders dan sporendragende organismen op de Endo-plaat worden gevonden, vegetatieve vormen moeten allen zijn gedood. Theorie der Methode: Ringeling's proef tot aankweeking van Coli-bacillen in melk is gebaseerd op de eigenschap van Bact. Coli, dat deze een zure reactie beter verdraagt dan de overige in melk voorkomende bacteriën. Bact. Coli wordt dus in de „zure bouillon' aangekweekt, doordat de overige organismen worden terug gedrongen. De Endoplaat moet uitmaken of het organisme werkelijk Coli is. De kans dat melk besmet raakt met „ziekte verwekkende kiemen" is groot. Tuberculose, maar veel meer nog de Typhus Abdominalis (door Typhusbacillendragers onder melkers en verkoopers) zijn ziekten welke door de melk kunnen worden verspreid (Typhus-epidemiën door melk). Het aantoonen van deze organismen in melk stuit op zeer groote bezwaren, zoo al niet tot de onmogelijkheden. Een negatief resultaat is dus van nul en geener waarde. Om de ziekteverwekkende kiemen uit de melk te verwijderen, wordt deze gepasteuriseerd (H uur bij 60-65» C. „lage" pasteurisatie, meest voorkomend of H uur bij 75-80» C. „hooge" pasteurisatie); alleen op voorwaarde dat deze pasteurisatie nauwkeurig geschiedt (juiste temp. binnen in flesch) worden werkelijk alle vegetatieve bacteriën-vormen gedood, daarmede dus ook eventueele Typhus-, Tuberkel-, Diphtherie- en Coli-bacïllen, enz. Het aantoonen van Coli-bacillen wordt dus ook hier als Indicator gebruikt om vast te stellen of de melk werkelijk behoorlijk is gepasteuriseerd geworden. In rauwe melk, hoe zuiver ook behandeld, komt steeds Bact. Coli voor (Faeces der koe). In gepasteuriseerde melk mag nooit Bact. Coli voorkomen. Katalase Reactie van Melk. (Aantoonen of de Melk „al of niet" is Gepasteuriseerd). Solut. Peroxydi Hydrogenii H202 1% Reagens: In den handel als 30% in geparaffineerde flesch (In bruine onbepaald houdbaar en 3% niet houdbaar. flesch bewaren). a. Monster te onderzoeken Melk. J Cl _! • ir L «» I Gecalibreerd Gasbuisje als zoodanig b. Steriel „Katalase"-buisje . ' 1 in den handel Utensiliën: of ... o* - , ■ r* u. :» I Gesloten been tot ombuiging ± Steriele Kleine-Gasbuis (9 ccM. inhoud. C. Steriele Pipet a 10 ccM. en steriele Pipet a 5 ccM. Techniek der Methode. I". Breng door middel van steriele Pipet 5 cc/W. H2 02 1% in gasbuis. Voeg daaraan toe met „ „ 10 ccM. melk. Meng goed en zorg dat er geen luchtbel boven aan gesloten einde der gasbuis is, drijf deze uit door steeds vloeistof naar het gesloten been te drijven. 2°. Laat bij kamer-temp. staan 24 uur of 2 uur bij 370 C. Bij positieve Katala.se reactie duidelijke gasbel aan het gesloten been der gasbuis. Behoorlijk gepasteuriseerde melk moet een negatieve Katalase reactie vertoonen. Meer dan 3 ccM. gas (02) mag rauwe melk niet bevatten, dit wijst anders op een bijzonder hoog bacteriën gehalte of op een uierontsteking der koe (veel Leucocyten). Theorie der Methode. Met Katalase wordt een ferment bedoeld dat H,02 splitst in Vrye O en H ,0. Alle levend protoplasma heeft in meerdere of mindere mate het vermogen om H202 op bovenstaande wijze te splitsen. In de melk zullen het in hoofdzaak de Bacteriën en de Leucocyten zijn, (in iedere melk aanwezig) welke deze fermentatieve werking, dit Katalytisch vermogen bezitten. Het Katalytisch ferment der melk wordt bijeen verwarming tusschen 60-65" C. vernietigd. Gepasteuriseerde melk mag deze reactie dus nooit vertoonen. Peroxydase-Reactie van Storch voor Melk. (Aantoonen of de melk „Laag" of „Hoog" gepasteuriseerd of „Gesteriliseerd" is). Reagentia: a. Zoutzure Para-Phenyleendiamine 2 gr. | Storch's Reagens Aqua Dest. 100 gr. | goed omschudden In bruin T K druppelfleschje van 50 gr. Steeds versch bereiden. Vloeistof moet kleurloos zijn (zoo noodig ontkleuren met koolpoeder). b. Solut. Peroxydi Hydrogenii H202 1/2 % versch bereiden. In den handels als 30 % in geparaffineerde In bruin T K druppelfleschje van flesch onbepaald houdbaar en als 3 % niet 50 gr. hoogstens 1 dag houdbaar, houdbaar. Cl. Monster te onderzoeken Melk. Utetisiliën: b. Reageerbuizen. C. Maatglas- of Pipet van 5 ccM. Techniek der Methode: Er behoeft niet steriel te worden gearbeid. 1°. Breng door middel van pipet of maatglas 5 ccM. melk in reageerbuis 2°. Voeg daaraan toe 4 druppels H202 XA % „ „ „ 2 druppels Storch's Reagens Controleer het Reagens eerst met rauwe melk. Reactie van Storch met „Rauwe" melk = Positief (^"J^sèco^en) /Donkerblauw na\ „ „ „ „Laag" Gepast. „ =Positief [enUeIe seconden) „ „ „ „ „Hoog" Gepast. „ = Negatief of Zwak Positief /Zwak blauw eerst\ ^ na 30 min. / „ „ „ „ „Gesteriliseerde" „ = Negatief Theorie der Methode: Met „Peroxydase" wordt een ferment bedoeld dat het vermogen bezit een atoom O van een peroxyd over te brengen op een gemakkelijk oxydabele stof^ Bij de reactie van Storch wordt een atoom O van het H202 overgebracht op het para-phenyleendïamine, hetwelk door de oxydatie blauw wordt. Het „peroxydase" ferment is waarschijnlijk gebonden aan de globulinen en albuminen van de melk. Dit ferment wordt bij + 74° C. gedood. Een negatieve Storch-reactie bewijst dus dat de melk boven 74" C. is verhit geworden. Het kan zich echter voordoen, dat melk met een negatieve Storch-reactie, een positieve Katalase reactie vertoont; dit kan alleen wanneer na de hoogere verhitting, de melk of opnieuw door bacteriën is besmet geworden, öf dat de daarin aanwezige bacteriën (sporendragers) gelegenheid krijgen (gunstige temp.) zich te ontwikkelen en daarmede het Katalytisch ferment te vormen. Overzichtstabel van Katalase- en Storch-Reactie van Melk. Katalase-Reactie Storch-Reactie „Rauwe" Melk -(- -)- „Laag" Gepast. „ -|- -J~ „Hoog'' Gepast. „ of na 30 min. ((+)) „Gesteriliseerde" „ Het kweeken van Anaerobe Bacteriën. (Bac. Tetani, Bac. Botulinus, Bac. Oedematis Maligni, Bac. Phlegmonis Emphysematosae, enz.) Voor het kweeken van obligate Anaerobionten (micro-aerophieien) moeten de levensverhoudingen in den voedingsbodem zoo zijn, dat de uiterst lage zuur stof-spanning (1 a 2 mM.) kan worden geboden, waarbij deze micro-organismen alleen kunnen groeien. De verlaging der zuurstofspanning kan op drie wijzen worden bereikt: a. De voedingsbodem zelve absorbeert de 02 n.m. Olycose-agar (reductie door glycose). I". Bij volle toetreding Lever-lever bouillon volgens Tarozzi (reduvan Zuurstof: ceerende leverfermenten). b. De Bact. zelve zoeken in den hoogen, vasten voedingsbodem (Hooge-agar) het niveau waar de juiste O-spanning aanwezig is. 2°. Door Chemische Ab- a. Pyrogallol Kalimengsel. sorbtie der Zuurstof: b. Phosphor. „ . , a. Doorvoeren van N. 3n. Door Physische ver- ^ „ drijvingderZuurstof: ö c. Uitpompen der lucht. Algemeene wenken omtrent voorbereiding van het Materiaal. Voor alles bedenke men, indien mogelijk, voor onderzoek veei materiaal te nemen. Obligate Anaerobionten zijn moeielijk te kweeken, sporen zuurstof reeds werken zoo vergiftigend, dat vele individuen daardoor afsterven. Hoe meer materiaal ter onderzoek komt, des te grooter kans van slagen. Aangezien Anaerobionten sterk neiging hebben aan elkaar te blijven kleven stuit het „rein" isoleeren op groote bezwaren. Een geïsoleerde oppervlakte-colonie bestaat hier volstrekt niet uit 1 soort. Telkens maar weer uitstrijken en uitzaaien voert, met veel geduld, ten slotte tot succes. Is het weefsel week (organen, vleesch, kaas, worst, aarde, enz.) zoo verdient het aanbeveling dit met geflambeerde schaar, vastgehouden door geflambeerd pincet, in kleine stukjes te knippen en deze over te brengen in buisje of kolfje bouillon, waarin zij zoo fijn mogelijk worden verwreven (met oogje of glazen staaf uitgegloeid). Ook kan men de stukjes eerst in mortier brengen, en met bouillon zoo fijn mogelijk verwrijven. Is het weefsel hard (piankharde spierstukjes, enz.), zoo probeert men deze toch stuk te knippen of in mortier niet bouillon krachtig fijn te wrijven. De kleine harde stukjes komen dan als zoodanig voor onderzoek. Etterige, en bloederig-sereuse Exsudaten komen als zoodanig in behandeling. Voor kleedingstukken, watten, iinnen, verband, enz. hier ook in kleine stukjes knippen, in bouillon brengen en 10 a 15 min. daarin laten weeken. Schudden van het materiaal in kolfje met glas-parels verdient soms aanbeveling. Voor alles zorge men het materiaal zoo fijn mogelijk te verwrijven ten einde de bacteriën van elkander los te maken. Het Voor-verwarmen van het materiaal ter aankweeking der Anaerobionten. Aangezien de „pathogene Anaerobionten" meestal tot de groep der „sporendragende" organismen behooren, verdient het aanbeveling het voorbereide materiaal kort te verwarmen (20 min. bij 80° C. in Waterbad) om de niet sporendragende organismen te dooden (vegetatieve vormen), op deze wijze dus de sporendragende organismen een voorsprong te geven, welke het reinkweeken gemakkelijker maakt. Breng daartoe van het fijngewreven materiaal in „agglutinatie-buisjes" (met pipet). Sluit buisjes goed met kurk en schuif deze nu door doorboorde kurk-schijf heen tot aan de buismonding toe. Laat de kurk-schijf op het water drijven; de buisjes hangen dan geheel in het warme water. Men verzuime echter nooit daarnaast toch een reeks kweekingsproeven met „onverwarmd" materiaal te doen, ter controle. De Dierproef ter aankweeking der Anaerobionten. Een der gewichtigste methoden tot „aankweeking" is het Dierexperiment. Men spuit 1/2 d 1 ccM. van het vloeibare materiaal of brenge een weefselstukje of ander vast materiaal (houtsplinter, glas enz. enz. aarde, kieedingstuk, watten enz.) onder de huid van de dij van het proefdier, (voor „vaste" stukjes klein knipje in huid geven, huid van bindweefsel losmaken met Sonde, in dit „zakje" stukje materiaal brengen, zoo mogelijk in de spier steken, desgewenscht met agrafe sluiten.) Steeds meerdere proefdieren tegelijk enten 2—4: Voor Bac. Tetani Witte Muis-Cavia „ „ Oedematis Maligni Muis-Cavia „ „ Phlegmonis Emphysematosae Cavia „ „ Botulinus Muis-Cavia j (' Hier materiaal (worst, vleesch) ook per os ingeven. " Bij dood der proefdieren (let vooral op typische symptomen, krampen en oedemen enz.) tracht men voornamelijk van de plaats van enting (spier, oedemen, ook harte-bioed enz.) de aangekweekte anaerobionten op een deionderstaande methoden rein te kweeken. Bac.-Botulinus sterft in het lichaam (37» c.) af, toxine geeft de zware vergiftiging. Dit organisme kan echter uit het voedingsmiddel worden gekweekt (24° C.) De meest gunstige „kweek-volgorde" voor het Uitgangsmateriaal: I. Schud-Cultuur volgens fiesse-Liborius-Veillon (Zie rag. 123) II. Vele coloniën hiervan op Lever-Lever Bouillon Tarozzi (Zie pag. 12S) III. Hiervan op Lever-Agarplaten v. R. („oppervlakte" cultuur zie pag. 135) IV. Coloniën hiervan op Lever-Lever Bouillon Tarozzi. V. Hiervan wederom op Lever-Agarplaten v. R. enz. enz. enz., totdat Cultuur eindelijk „rein" is. Het Reinkweeken van Anaerobionten bij volle toetreding van Zuurstof. Schud-Kuituur volgens Hesse-Liborius-Veillon. V oedingsbodem 2 o/o Bouillon-Agar + 2 o/0 Glycose (reduceerende stof) Aftappen in steriele buizen,hoog vullen ± 2/3 der buis. Steriliseeren 20 min. bij 100° C. Voedingsbodems met Glycose mogen niet hooger dan bij 100" C. worden verwarmd en dit zelfs ook niet te lang. De agar zonder glycose wordt dus eerst in kolfje 1 uur bij 110" C. gesteriliseerd, daarna de glycose toegevoegd, laten oplossen, uitgieten in steriele reageerbuizen, na steriliseeren 20 min. bij 100" C. a. 4 Hooge Agarbuizen. b. 4 Steriele Pipetten van 1 /4 ccM. Utensiliën: c' PaPiniaansche Pot- d. Platina oogje, liefst 2 X z°o lang als gewoon (om diep in voedingsbodem te kunnen ingaan). e. Bak Creoline of Sublimaat (voor infectieus-materiaal). Techniek der Methode: 1°. Kook 4 hooge agarbuizen in Papiniaanschen pot op, flink doorkoken (10 min.) om de lucht uit de voedingsbodems te verwijderen. 2°. Koel de gesmolten agar-buizen af (onder waterstraal) totdat zij nog net even in de hand kunnen worden gehouden (+ 40—45° C.) of plaats deze in waterbad van die temperatuur. 3°. Plaats de buizen in ent-statief onder elkaar. 4°. Ent nu den vloeibaren agar als volgt, spoedig, anders stolt de agar: Schema der verdunningen: a. Breng met steriele Pipet 1 (zie techniek pag. 11) I). Breng met steriele Pipet 2 c. Breng met steriele I Pipet 3 d. Breng met steriele I Pipet 4 '/4 ccM.van Uitgangsmateriaal in Buis I '/4 ccM. uit Buis I in Buis II J '/4 ccM. uit Buis II in Buis III J '/4 ccM. uit Buis lil in Buis IV J Verwijder pipet in desinfectans Meng door heen en weer bewegen der agarbuïs, en plaats deze wederom in statief idem idem idem Is het materiaal vast en hard, zoo laat men een klein stukje, door middel van uitgegloeid oogje of pincet, in de eerste Agar-buis vallen, en vervolgens telkens XA ccM. van de eene buis in de daaropvolgende buis, (zie afbeelding). Culturen van Anaerobionten moeten „voorzichtig" worden gemengd, anders wordt er teveel „lucht" (02 )in geschud. Laat buizen „vertikaal" stollen. Kweeken uit Bloed van Patiënt (Anaerobe streptokokken, enz. enz.) Aanbeveling verdient het voor dit doel grootere en bovenal wijdere reageerbuizen te nemen, doorsnede 3% cM. en deze hoog met glycose-agar te vullen. Door vcna punctie (aspireeren in Injectiespuit) wordt bloed verzameld, hiervan enkele ccM. laten uitloopen in iedere buis met uitgekookten tot 40—45° C. afgekoelden agar, goed mengen en vertikaal laten stollen. 5°. Plaats de buizen bij 37° C. 1 a 2 X 24 uur. Zoo men wil, kan ook nog bloed opgevangen worden (in dalende hoeveelheid, voor het verkrijgen van geïsoleerde coloniën) in „gewone" buizen met hoogenglycose Agar. Na voorzichtig mengen, dadelijk uitgieten in steriele Petri-schalen (zie voor techniek pag. 96). Deze moeten dan in Buchner-flesch (zie pag. 135) of Klok van Klein (zie pag. 139) anaerobiontisch worden gekweekt. Bij voldoenden groei is de agar kolom bezet met kleine coloniën, welke op eenigen afstand van elkaar zijn gelegen, en zich daar hebben gevormd waar de gunstigste 02 spanning aanwezig was, dus beneden de agar-oppervlakte. Heeft er energieke gasvorming (uit de glycose) plaats gehad, zoo wordt de stijve agarkolom dikwijls uit elkaar gescheurd, zooals nevenstaande afbeelding te zien geeft. Deze methode eigent zich het meest voor het „isoleeren" van den rein-cultuur. Zij is het „eerste aan bod" voor het bewerken van het „uitgangs-materiaal". Het afenten der Coloniën uit de Buis van HesseLiborius-Veillon, volgens Kenrich. Het a/enten der Bacterie-coloniën (om de reincultuur te verkrijgen) uit de stijve hooge agar-kolom, stuit op groote bezwaren. Met een platina naald of oogje zijn de diepliggende coloniën van boven uit onmogelijk te bereiken. Men ga dus als volgt te werk: Cl. Reageerbuizen-houder. b. Steriele Petrï'sche schaal. Utensiliën: c: Platina Oogje, liefst 2 X zoo lang als gewoon. d. Mesje. £. Voedingsbodem om afgeënte Coloniën in over te brengen. Tarozzi-Bouillon, later Lever-agar v. Riemsdijk, enz. Techniek der Methode: 1°. Verwarm bodem van reageerbuis. De agar wordt van buiten iets week en laat van den wand los. Door de uitzetting van de lucht en den waterdamp door de verhitting, wordt de agar-kolom steeds opgeduwd. De vlam wordt steeds gehouden onder den bodem van de opschuivende agar-kolom en vooral wordt de vloeistof verhit welke zich om en bij dezen bodem heeft gevormd. De agar-kolom wordt nu voortdurend opgeduwd en zal eindelijk uit de reageerbuis schuiven en opgevangen kunnen worden in de Petri'sche schaal, welke daarna wordt gesloten. 2". Tracht nu met uitgegloeid platina oogje: a. Uit de diepste lagen alleen goed geïsoleerde coloniën aan te prikken (vele) en over te brengen ieder in 1 buis Tarozzi's bouillon, diep in. b. Is de wijze van enten als onder a bezwaarlijk, omdat de coloniën te diep in de agar-kolom gelegen zijn, zoo flambeert men een mesje en snijdt daarmede onder voorzichtig openen der schaal, de agar-kolom in schijfjes. Ent nu uit deze schijfjes (onderste lagen) met het „lange" oogje goed geïsoleerde coloniën af (vele) en breng deze ieder in 1 buis Tarozzi's-bouillon, diep in. (Voor Streptokokken enz. in bloed-bouillon of op bloed-agarplaten.) Het verdient aanbeveling de colonie „omgeven te laten" door brokje agar; dit beschut haar nog eenigermate tegen de O2 der lucht bij het overenten. De colonie wordt nu met het „lange" oogje diep in den Tarozzi-bodem gebracht of daar in een stukje lever „ingeboord". Plaats de culturen bij 370 C. enkele dagen. Verdere bewerking der Culturen. Na voldoenden groei uit ieder der Tarozzi-culturen een „controle" enten op gewonen Agar aerob, om te zien of het een obligate anaerobiont is; deze mag nooit cultuur op „aeroben"-agar geven. Is dit wel het geval, zoo heeft men met een „facultatieven"-anaerobiont te doen of het is geen „rein-cultuur" geweest. In ieder geval van alle culturen op Lever-Agarplaten enten (zie pag. 135) streepsgewijze over oppervlakte (zie voor enting pag. 103) teneinde opnieuw geïsoleerde coloniën te krijgen. Hiervan weer op Tarozzi's bouillon, enz. enz. (zie pag. 128) totdat eindelijk de „rein-cultuur" is verkregen. Zie voor „differentieel-diagnostische" voedingsbodems teneinde deze „reinculturen" te Identificeeren, de specialistische handboeken. Theorie der Rein-kweekingsmethode volgens Hesse-Liborius-Veillon. Door het uitkoken van den agar in den Papiniaanschen pot, wordt zooveel mogelijk de lucht, dus ook de 02, uit den voedingsbodem verdreven. Door het telkens overbrengen van materiaal van de eene agar-buis in de andere, wordt dit steeds aanmerkelijk verdund, en wordt in de laatste der agar-buizen een zoo sterke verdunning verkregen, dat de bacteriën los van elkaar in den agar gesuspendeerd blijven. Door het stollen van den agar worden zij op die plaats gefixeerd en groeien uit tot den voor hun soort typischen colonie-vorm. Dit uitgroeien tot coloniën zal alleen op die bepaalde hoogte der agar-kolom kunnen plaats vinden, waar de juiste O,,spanning aanwezig is, dus steeds aanmerkelijk beneden het agaroppervlak. Begrijpelijk is het nu tevens waarom de buizen zoo hoog met glycose-agar moeten worden gevuld, hoe hooger, hoe grooter de kolom zijn kan waar die lage 02-spanning geboden kan worden. De glycose in alkalische omgeving zorgt voor reductie der 02 binnen in den voedingsbodem. Door het afenten der geïsoleerde coloniën kunnen rein-culturen worden verkregen. Lever, Lever-Bouillon volgens Tarozzi voor het instandhouden van Reinculturen. Met eenige wyzïgïng van M. van Riemsdijk. Tarozzi's Lever, LeverBouillon Utensiliën: Runderlever . K Kg. Pepton (Witte) 10 Gr. Glycose ... 10 Gr. NaCl .... 5 Gr. Water . . . 1000 Gr. NaOH ... i/]0 N. Phenolphtaleïne /Phenolpht. . 1 gr.\ \70% Alcohol 100 gr.) Carbonas Calcicus ( Steriliseeren \ V3X 1 uur bij 1200 c.) Steriele Reageerbuizen Bereiding: lo. Snijdt de lever in stukken. 2o. Kook met 1 L. water XA uur. 3o. Filtreeren (papier No. 596). 4o. Neutraliseeren met 1 /10 NaOH tot neutraal Phenolph. punt. 5o. Vloeistof koken. 6o. Filtreeren. 7o. Glycose toevoegen. 8o. Wasch de stukken lever op zeef onder de kraan, om deze van eiwit-stolsels te ontdoen. 1) 9o. Snijdt de brokken gekookte lever in stukjes van 1 è 2 cm. lOo. Doe in iedere steriele reageerbuis een schepje steriel krijt en 3-5 stukjes lever. llo. Vulde buizen met de lever;— Stukjes lever bouillon. 12o. Steriliseer 3 achtereenvol- Krijh gende malen Ku. bij 1000 C. 13o. De overgebleven aan stukjes gesneden lever in steriele kolf doen, steriliseeren en bewaren. 14o. De overgebleven lever-bouillon evenzoo. Techniek der Methode: 1°. Ent op de gewone wijze (zie pag. 4—11) van het materiaal in de Tarozzi Lever, Lever-bouillon, vooral niet te weinig, % ccM. vloeibare cultuur met pipet of gelieele colonie van plaat. 2". Plaats in broedstoof 37° C. 2 X 24 uur of langer. Bacterie-ontwikkeling is vast te stellen door gelijkmatige troebeling der vloeistof, duidelijke gasvorming en nnaangenamen stank. Deze voedingsbodem leent zich bijzonder voor het „instanci houden" van Anaerobe-Reinculturen. Theorie der Methode: Leverweefsel en het waterig aftreksel van dit weefsel hebben een zoo sterk reduceerend vermogen (reduceerende Fermenten), dat anaerobe bacteriën, bij volle toetreding van zuurstof daarin welig kunnen groeien.' Deze groei vangt onder in den voedingsbodem aan, tusschen en in de stukjes lever, waar de anaerobiose het volkomenste is; van lieverlede kruipen de bacteriën omhoog. Door de groote hoeveelheden gas, (uit de Glycose) welke meestal door 1) Dit houdt de latere troebeling der bouillon tegen, Zeissler-Handbuch der Mikrobiologischen Techniek, Urban v. Schwarzenburg, Berlin. anaerobe-bacteriën worden geproduceerd, stijgen er steeds gasbellen naar boven, deze drijven de luchtbellen, welke nog in de bouillon zelve aanwezig kunnen zijn, voor zich uit naar buiten, zoodat het anaerobiontisch milieu steeds volkomener wordt, de bacteriën zelfs tot boven in de vloeistof kunnen groeien. Het kryt onder in den voedingsbodem dient om het zuur, dat dikwijls in hooge mate door anaerobe-bacteriën wordt geproduceerd en op den duur de bacteriën zelve zeer schaden kan, te neutraliseeren. De lever-leverbouillon als zoodanig wordt na verloop van tijd spontaan zuur, wat soms de cultuur kan doen mislukken; het krijt dient dus ook om dit zuur te binden. Het verdient aanbeveling nu en dan het krijt door de vloeistof heen te verspreiden (voorzichtig heen en weer bewegen der vloeistof), om de zuur-binding zoo volkomen mogelijk te maken. Het kan zich wel eens voor doen, dat de culturen na maanden-lang verblijf in de Tarozzi-bouillon daarin oogenschynlyk afsterven (m.a.w. een overenting in nieuwe Tarozzi geeft geen groei). Een passage door Hooge Glycose-Agar doet echter zien, dat de cultuur niet dood was. Hiervan wederom op Tarozzi's bouillon geeft opnieuw weelderigen groei. Het Reinkweeken van Anaerobionten door verdrijving der Zuurstof. Van de methoden, waarbij de Zuurstof uit den voedingsbodem wordt verdreven (absorbtie door Pyrogallol-Kali, doorvoeren van N of H, uitpompen der lucht) is de Pyrogallol-Kali methode voor de praktijk het eenvoudigst, het doelmatigst en het minst gevaarlijk. Vrije zuurstof werkt vergiftigend op anaerobionten; een vereischte is dus, de 02 zoo spoedig mogelijk uit omgeving en voedingsbodem te verdrijven. De voedingsbodem. Om deze Oz resorbtie te bespoedigen, wordt er in den voedingsbodem zelve, nog een reduceerende stof gebracht (Olycose) of de voedingsbodem vervaardigd van stoffen, welke dit vermogen in hooge mate bezitten (Lever). De voedingsbodems moeten steeds even voor het gebruik flink worden uitgekookt (in Papiniaanschen pot) oin de lucht daaruit te verdrijven, vervolgens plotseling (waterstraal) worden afgekoeld. Aan te bevelen zijn: Voor het maken van Reinculturen — 2% Glycose-Agar in buizen schuin. » t> » i> „ —Lever Agar V. /?. in buizen schuin (zie pag. 135) Voor het verkrijgen van Toxine = 0.2 % Glycose-Bouillon (Tetanus, Botulinus, enz.) = Lever-Boilillon(zie pag. 128 tot en met 7) Belangrijk is het te weten en dit steeds gedurende de kweeking te blijven controleeren, in hoeverre de zuurstof werkelijk uit den voedingsbodem is verdreven geworden (constateeren van lekken enz. enz.) Daarvoor is volgenden Indicator aan te bevelen: Indicator voor het aantoonen van Sporen Zuurstof volgens M. van Riemsdijk.') a. WaterigeMethyleenblauw-oplossing jMethyl. BI. Höchst.50mgr. In bruin T.K. druppelfleschje 50 ccM. rAqua Dest 30ccM. inhoud. 2) ' (Goed schudden) b. Glycose oplossing 10% in Aqua Dest Utensiliën: Oplossen door opkoken, filtreeren, overgieten in steriel Pasteur"s kolfje; goed opkoken. Kolfje van boven afsluiten met plasticine, monding van kolfje met vaseline bestrijken voor goede afsluiting. (In donker lang houdbaar). C. Natronloog (N). (bruin T.K. druppelfleschje 50 ccM. inhoud) d. Reageerbuis, desnoods met melkglas (wijd) e. HydropHielgaas (dubbel) in reepjes geknipt. ƒ. Maatglaasje 10 ccM. g. Platina oogje. Techniek der Methode: 1°. Meng in maatglas 3 ccM 70% Glycose-oplossing 1 druppel Methyleenblauw ïndicator/ „ NaOH N vloeistof. Goed mengen. Laat bij het druppelen de eerste druppels wegloopen, opdat de druppels zuiver van grootte blijven. Houdt de druppel-kanalen rein. 1) M. van Riemsdijk Centr.bl. für Bakt. Bd. 88 Hft 3. 2) Druppel-grootte T.K. fleschje = 7 druppels per X ccM. 2°. Drenk reepje dubbel Hydrophielgaas in deze vloeistof (zorg dat het gaasje vlak blijft, spreidt het daartoe met oogje in maatglas uit). 3°. Spreidt het gaasje tegen wand van reageerbuis uit (met oogje) of tegen wand van ander receptaculum (vooral vlak.) 4°. Plaats de reageerbuis met blauw gaasje in het receptaculum dat 02-vrij moet worden gemaakt, even voor dat de „afsluiting" van het vat plaats vindt. Eerst bij volkomen „zuurstof-vrijheid" zal het gaasje geheel ontkleuren. Men lette er op dat de N NaOH niet terugloopt, de reactie vertraagt daardoor merkbaar, (goed afsluiten dusl. Theorie van den Zuurstof-Indicator. Alkalische Glycose-oplossing heeft sterk reduceerend vermogen. Methyleenblauw is door reductie gemakkelijk in een kleurlooze verbinding over te voeren. Sporen 02 hebben echter het vermogen deze kleurlooze verbinding wederom te oxydeeren tot de oorspronkelijke blauwe kleur. Zoolang er dus 02 aanwezig is, kan deze kleurlooze verbinding nooit optreden; is er geen 02 meer aanwezig, zoo is de reductie door de glycose volkomen en blijft de kleurlooze verbinding bestaan. Deze indicator is uitermate gevoelig; 2/5 mM. wordt er nog door aangetoond. De meest obligate anaerobionten (B. Butyricus) vertoonen dan ook weligen groei in een milieu, waarin de ZuurstofIndicator kleurloos wordt. De Reactie-snelheid van dezen Indicator is 20 min. m.a.w. in een zuurstof-vrye ruimte heeft de Indicator 20 min. noodig om kleurloos te worden. Deze 20 min. mag men dus steeds van het totale tijdsverloop welk het kleurloos worden van den Indicator in beslag neemt, aftrekken. Bij „lekken" van het vat, wordt de Indicator terstond blauw. Methode tot het Zuurstofvrij maken van Reageerbuizen en Kolfjes volgens Wright-Burri. Eenigszins gewijzigd door M. van Riemsdijk. Acid. Pyrogallicum 20 O/o of 44 0/o (in bruine flesch in donker Reagentia: bewaren, zeer lang houdbaar, al is de vloeistof donker bruin geworden) Kaliloog 20 %. a. Buizen en Kolfjes voorzien van 2 Wattenproppen boven elkaar, de onderste prop van „glaswol" (losse prop) de bovenste prop van „gewone" watten. b. 2 Pipetten a 1 ccM. C. Ontvette Watten. Utensiliën: d' )(ett' " e. Goed passende caoutchouc kurken. f Was-Vaseline mengsel, <0 gr. was opsmelten, toevoegen 30 gr. vaseline, mengen en laten stollen. g. Zuurstof-Indicator (zie pag. 130). h. Pincet. i. Papiniaansche pot. Techniek der Methode: 1°. Kook voedingsbodem uit in Papin, pot en koel plotseling af onder den waterstraal (buizen schuin houden). 2°. Verwijder met pincet de bovenste wattenprop. 3°. Trek glaswol-prop er uit, doop deze met de punt even in de zuurstof Indicator-vloeistof en plaats deze wederom op de buis, de prop diep in den buishals naar onderen drukkende. Gewone wattenprop Glaswolprop Paraffine of Was. Caoutchouc kurk. Propje watten. 1 ccM. Pyrogalzuuroplos.44% Propje ontvette watten. 1 ccM. Kaliloog 20 %. Propje ontvette watten. Propje vette watten. Naar onderen geschoven „glaswol"prop Zuurstof-Indicator. 4°. Breng op glaswolprop vette watten (goed aansluiten). 5°. Op vette-watten, propje ontvette watten. 6°. Druppel hierop (met pipet) 1 ccM. KOH 20 o/o. 7°. Bedek met prop ontvette watten. 8°. Druppel hierop (met pipet) 1 ccM. Pyrogallol 20 o/c of 44 o/0. 9°. Spoedig bedekken met wattenprop. 10°. Spoedig afsluiten met Caoutchouc kurk. 11°. Omgeef rand van buis met was-vaseline, tot algeheele afsluiting der lucht. 12°. Plaats in broedstoof 37° C. enkele dagen. Indien de „afsluiting" doelmatig is en blijft, de 02 resorbtie normaal verloopt, zal na ±2 uur de blauwe indicator-vloeistof aan glaswolprop totaal ontkleurd zijn. Eventueele „lekkages" vertoonen zich dadelijk door „blauwkleuring" van den indicator. Wil men de culturen nadat de buis geopend is geworden, langdurig bewaren, zoo verdient het aanbeveling, de glas-wolprop door gewoon wattenpropje te bedekken. Deze methode eigent zich voornamelijk voor reeds „rein" gekweekte culturen, wanneer deze „weinig" in aantal zijn. Theorie der Methode: Acidum Pyrogallicum heeft in Alkalische omgeving, in hooge mate het vermogen zuurstof te absorbeeren, onder bruin-kleuring der vloeistof. Bij een juiste verhouding der beide reagentia tot elkaar (overmaat KOH) is de 02-resorbtie zoo sterk, dat er die uiterst lage 02-spanning ontstaat, waarbij de meest obligaten onder de Anaerobionten (Bac. Butyricus) welig tot ontwikkeling kunnen komen. De glaswol-prop is daarom aan te bevelen, aangezien deze veel losser is dan de gewone wattenprop, de 02-resorbtie daardoor veel vlugger verloopt. Proeven hebben bewezen, dat de Zuurstof-Indicator bij gebruik der glaswol-prop reeds na 2 uur was ontkleurd, bij de gewone wattenprop ± 24 uur noodig bleek, om deze te ontkleuren. „Glaswol" is zeer voldoende om bacteriën van buiten tegen te houden. Het Zuurstofvrij maken van meerdere Buizen of Kolfjes tegelijkertijd volgens Buchner. Eenigszins gewijzigd door M. van Riemsdijk. . „ ... .. _ 1 In bruine flesch Acid. Pyrogallicum 44 0/0 50 ccM. ' in donker lang r> x- ,, ... > houdbaar. Reagentia: Kaliloog 20/c 100 ccM. Indicator-vloeistof en gaasjes (zie pag. 130) Terpentijn. a. Stopflesch (laag en wüd, zie pag. 137), waarin reageerbuizen en zoo noodig kolfjes passen en waarvan inhoud precies met water is nagegaan). b. Reageerbuizen, (kolfjes) met voedingsbodem, voorzien van glaswol-prop en daarboven gewone wattenprop (zie pag. 132). Utensiliëtv Reageerbuizen kunnen korter zijn b.v. 12 cM. C. 2 Maatglazen 25 ccm. d. Ledige reageerbuis (zonder prop) voor Indicator. e. Papiniaansche pot. f. Was-vaseline mengsel (70 gr. was opsmelten, toevoegen 30 gr. vaseline, mengen en laten stollen). g. 2 Trechters. Benoodigde hoeveelheid Pyrogallol en Kaliloog. !) , . , . _ _ 3 ccm. Pyrogallol 44 % Voor een fiesch-inhoud van 400 ccm. = lfl 10 ccm. KOM 20 ?r 3 5 01 ■3 n> 80 Ott n n a* Zorg dat de Suspensie niet hooger reikt dan tot aan de „doorboorde kurk". Houdt „Tulpe" vertikaal in de hand (dunne einde) zoo, dat de „kurk" naar achterwand is gericht. Breng pipet in de „Tulpe", laat volloopen en sluit deze van boven met vinger af. Laat nu bij het uitnemen de pipet langs de kurkschyf glijden, (voor het „afvegen" van het aanklevende vocht). Vermindert de vloeistof sterk, zoodat alleen het „dunne" reservoir nog vol-is en men wil toch nog voldoende vloeistof inhevelen, zoo houdt men Tulpe schuin (kurk naar achterwand) en hevelt vloeistof in zooals fig. op pag. 151). Zie voor het maken der „suspensie" in de „Tulpe" pag, 166. Het desinfecteeren en steriliseeren der Pipetten: De pipetten kunnen indien noodig, in den stoomsterilisator ontsmet worden, zonder dat de gradueering er af gaat. Pak de pipet in als op pag. 10. Het desinfecteeren kan ook in creoline, lysol geschieden, men late de pipet daarin een poos staan, zie fig. pag. 153. Bij het verrichten der reactie met verschillend bacteriën-materiaal op hetzelfde tijdstip, is aan te bevelen de pipetten tusschen de verschillende reacties in, ter desinfectie even in warme glycerine te doopen: neem reageerbuis met glycerine, verwarm boven de vlam tot 150—1800 C. (kookpunt 290° C.) en laat de gebruikte pipet er even in staan. De bacteriën zijn dan spoedig gedood. Serologische Reactiebuisjes en Rekjes. ') A. Buisjes volgens M. van Riemsdijk. 2) Het meest aan te bevelen zijn korte buisjes met dikken wand (minstens 1J^ mM. dik), zooals onderstaande figuur. Door den „dikken" wand worden de vlokken 2 d 3 x vergroot. De „trechtervormige" bodem maakt dat de vlokken zich opstapelen, waardoor scherpe atlezing. Het ,,glas-voetje" neemt de hinderlijke „lichtbreking" weg, welke steeds bij de bodem-ronding ontstaat. De „kleur-echtheid" der vlokken is in deze buisjes veel sterker. Het vervaardigen der Serologische Buisjes. 3) ^ Diameter 10 mM. Buig-buis (Thüringer glas) [ Wanddikte ' minstens 1>£ „ De buisjes worden uit 1 stuk glas gemaakt en zoo in de blaasvlam uitgetrokken, dat de „trechtervormige" bodem ontstaat tegelijk met het „voetje". Op deze wijze kan het voetje nooit afbreken. Deze buisjes zyn zeer weinig breekbaar. Diameter 10 mM. Diameter 5>t mM. B. Agglutinatiebuisjes (korte) 1 Lang 6 cM. als zoodanig in den handel / Diam. i Deze buisjes geven minder nauwkeurige resultaten dan A, wegens den dunnen wand en de sterke lichtbreking. 1) M van Riemsdijk. Uber eine verbesserte Optik der Ausflockungsreaktionen enz. Centr. bl. für Bakt. Bd. 91 Hft. 2 1923. _ x 2) Kunstglasblazer L. E. Hoefakker (2e Jan Steenstraat 121, A'dam) maakt deze buisjes volgens voorschrift. ^ D, u 3) Buisjes, Rekjes, Pipetten en Tulpen verkrijgbaar bij: Firma Goldberg, Bleibtreustrasse 40, Berlijn—Scharlottenburg 2. Reiniging der Buisjes. Buisjes voor serologische reacties moeten vóór alles zorgvuldig gereinigd zijn (geen vlokjes, oneffenheden, krasjes, vlekken, enz., welke het aflezen der fijne uitvlokkingen belemmeren of verkeerd voorstellen) en neutraal reageeren (licht zure reactie kan een positieve agglutinatie-reactie uitlokken.) „Nieuwe" Buisjes: 1». 24 uur laten liggen in Water + H,S04 aa (om het Alkali van den glas-wand te neutraliseeren). 2». Daarna telkens, telkens spoelen in leiding-water totdat het water geen spoor zuur meer bevat (controleer met lakmoespapier). 3». Eindelijk naspoelen in Aqua dest. Water uitslaan en buisjes drogen in broedstoof op filtreerpapier. Zoo noodig buisjes van binnen na wrijven met „oor-sponsje" of dotje watten aan glas-staaf of metalen steel. Na dezen éénen keer komen de buisjes nooit meer met Zuur of Alkali in aanraking. „Gebruikte" Buisjes met Infectieus Materiaal: lu. Giet in buisjes zwakke oplossing van Creoline (geen sublimaat, dit laat zich niet van den glaswand verwijderen). 2Ü. Laat 2 £ 3 uur staan. 3». Bevestig aan kraan Pasteur'sche pipet, door middel van caoutchouc-slang. 4». Spoel iedere buis afzonderlijk en energiek uit, door de Past. pipet op bodem te brengen en de kraan sterk te laten loopen (Buisjes A blijven altyd in rekje staan). Zoo noodig buisjes nawrijven met „oor-sponsje". Serologische Buisjes moeten volkomen „rein" en „helder" zfln. Het verdient geen aanbeveling Serologische Reactiebuisjes uit te koken (sodawater enz.) ter desinfectie van den inhoud. De „helderheid" en „gaafheid" van het glas gaan spoedig achteruit, om nog niet eens te spreken van de grootere breekbaarheid. Men houde de zoo gewichtige reiniging in eigen beheer en onder eigen controle. De Rekjes. Noodzakelijk is het de buisjes met verdunningen zeer nauwkeurig te registreeren, onder ieder buisje de betreffende verdunning op te teekenen, om verwarring te voorkomen. De rekjes moeten dus zoo zijn, dat „optisch" de meest gunstige „verhoudingen" worden geboden, te samen met het gemakkelijk aanbrengen van aanteekeningen. Buisjes A worden het best opgesteld in rekjes van natuur-kurk ')3) (geen gecomprimeerde kurk), met opstaanden achterkant, half zwart, half wit geschilderd, teneinde een zoo scherp mogelijk „kleur-contrast" te krijgen (zie fig. pag. 156). Kurk is zeer duurzaam en licht en wordt door vloeistoffen niet aangetast. Rekje voor de „reactie" zelve. Rekje voor de „stam-verd." v.h. serum. Het vervaardigen der Rekjes volgens M. van Riemsdijk. ') 3) Rekje voor de Reactie als zoodanig Kurk-plankje (glad) 1 van natuur-kurk j Lang 22 cM. : Breed 6 „ Dik 2 „ 10. Boor midden in „bovenvlak" 12 gaatjes (met kurken-boor), kleiner dan „glas-voetje" der buisjes, 1 cM. tusschen 2 gaatjes, en van 1 cM. diepte, te beginnen met 2 cM. van den kant. 2». Achtergebleven kurk-stukjes worden door middel van pincet uit de gaatjes uitgetrokken. Buisjes moeten „stijf" in gaatjes geklemd zijn. 3». Aan achterwand van kurk-plankje wordt gespijkerd dun houten plankje 4 cM. hoog (steekt dus 2 cM. uit). 4°. Aan voorste hoeken van kurk-plankje 2 korte glas-staven met platten knop, welke in te klein gaatje worden geklemd (zij dienen als handvat). Rekje voor de „stamverd." van het Serum Kurk-plankje (glad) van natuur-kurk )Lang 22 cM. Breed 3 „ Dik 2 „ 1». Boor de gaatjes precies zooals fig. aangeeft, ieder gaatje juist tegenover het correspondeerende gaatje van het „groote" rekje (zie fig.). Leg daartoe beide kurk-plankjes tegen elkaar aan. De gaatjes moeten hier iets wyder zijn, buisjes moeten er gemakkelijk in en uit kunnen. Het Schilderen van de Rekjes. Rekje voor de Reactie De gaatjes (ook van binnen) -f- daarachterliggend kurk-oppervlak -f- houten achter-plankje | Zwart schilderen met doffe schoolborden-verf Kurk oppervlak voor de gaatjes (zie fig.) J | Wit schilderen met [ Ripolin-glansverf, enkele | malen, opdat alle gaatjes in I de kurk worden opgevuld Rekje voor de Stam.-verd. Geheel Kurk-oppervlak wordt „wit" geschilderd (zie fig.) | Idem. Buisjes B worden geplaatst in „rekjes" zooals die in den handel zijn. (zie pag. 154) Om de buisjes daarin vaster te bevestigen en aanteekeningen mogelijk te maken ga men als volgt te werk: Leg op het rekje een reep filtreerpapier (breeder dan rekje) prik er gaatjes in, overeenkomende met de gaten in het rekje en druk de buisjes er door heen. Op het papier kunnen aanteekeningen worden gemaakt. Serum Patiënt -f- Typhus Ficker. OO O O ooooo Controle 1 : 50, 1 : 100, 1 : 250 1 : 600, 1 : 1000, enz., enz. Plasticine. Een aardige methode voor het „vast-zetten" van kleine reactiebuisjes (welke in geen enkel rekje behoorlijk passen) is in „plasticine" (soort klei, verkrijgbaar in speelgoed-winkel). A. Verdeel de plasticine over oppervlakte van Petri-schaal (bakje), leg daarover het papier met de aanteekeningen, prik er gaatjes doorheen en druk de buisjes door het papier heen. B. Verdeel de plasticine over ongebruikte photographie-platen (mat-gedeelte), bevestig de buisjes er in. Op de gele gelatine-laag der plaat kan gemakkelijk met potlood worden geschreven. De Agglutinatie Reactie. Brengt men Immuunserum met een homologen, bacteriënstam (Suspensie in zoutsoiutie) samen, dan ontstaat er een „agglomeratie" (Hoopjesvorming) en „immobilisatie" (totale bewegingloosheid) der bacteriën, een biologisch proces, dat als „agglutinatie" bekend staat. De agglutinatie-reactie kan op tweeërlei wijzen uitgevoerd worden, al naar de herkomst van het te onderzoeken materiaal: Agglutinatie I. Reactie van Widal. Onbekend serum (serum patiënt) + Bekende bacillen Ficker's Diagnosticum = doode bacillen of Goed agglutineerbare reincultuur = levende bacillen. Agglutinatie II. Reactie van Gruber. Bekend serum (Konijnen-Immuunserum, gedroogd in den handel of vloeibaar Serum van het Proefdier) + Onbekende bacillen. (Bacillen van patiënt). Het Serum. Het Serum is afkomstig: a. Van den Patiënt Agglutinatie I j Wordt in vloeibaren toestand gebruikt. b. Van het Proefdier Agglutinatie u j Woidt in vloeibaren en in vasten (gedroogden) toestand gebruikt. Vloeibaar Serum (van patiënt). Agglutinatie i. Het arbeiden met de Serologische Pipet (zie pag. 147 enz.) maakt het mogelijk met zeer kleine quantiteiten Serum te kunnen arbeiden. Er is dus weinig bloed noodig, wat een groot voordeel beteekent voor den Patiënt. Het bloed laat zich door die omstandigheid op zeer eenvoudige, aangename en niet pijnlijke wijze ontnemen. Men ga daartoe als volgt te werk: Ontnemen van Bloed bij den Patiënt: Vaccino-style van Mareschal (Zgieuff) I. Bloed-buisje volgens Wrïght. „Haakvormig" uiteinde A overdwars gezien. Door de „uitbochting" blijft de haak steeds naar boven gericht, wanneer het buisje wordt neergelegd. In den handel 100 Ex. in doosje 1) I Vervaardiging Wright'sche Buisje. 2) Op deze wijze ontstaat de „uitbochting" in het haakvormige deel. II. Of Agglutinatie-buisje, goed dichtgekurkt. „Dun" caoutchouc slangetje (+ 20 cM. lang) of „dunne" Nelaton-Katheter. Klein Vlammetje \ Micro-Brander \ Was -Lucifer ) Klein Kaarsje „Driekantig" Vyltje. Bekerglas of Kopje met „heet" water Water en Zeep Watten Alcohol 96 % en Aether. 1) Verkrijgbaar bij Instrumenthandel Salm, Amsterdam. 2) Sir A. E. Wright. Technique of the Teat and Capillary Glass Tube, London Constable Co. Aangewezen Plaatsen voor het ontnemen van Bloed: Duim (nagelbed, hieraan voorkeur). Oorlelletje (zeer bloedrijk) Hiel (bij kleine kinderen) Voorbereiding tot de Bloed-Afname: 1°. Laat handen goed reinigen. 20. Houdt duim in heet water + 5 min. 3o. Breek punt af van beide uiteinden van het Wright'sche bloed-buisje (zoo noodig eerst met „vijltje" krasje geven) en leg dit op stukje watten. 4°. Wrijf Vaccino-style af met Alcohol en Aether (watje) en leg dit neer tegen het bloed-buisje aan, opdat de punt „vrij" blijft. 5n. Wrijf nagelbed van duim flink af met Aether (watje) (Aether werkt vaatverwydend.) Vooral goed droog wrijven, anders vloeit het bloed over de huid uit, inplaats van als regelmatige druppels te vloeien. 6°. Sla caoutchouc slangetje enkele malen om 2e lid van duim (2), trek dit aan en druk duim daarbij energisch op wysvinger, in den stand zooals de fig. aangeeft. De Bloed-afname. 70. Terwijl nagelbed op zijn sterkst gestuwd is (aantrekken van slangetje, drukken van duim op wijsvinger) steekt men punt van Vaccino-style onder de huid van het nagelbed; houdt vaccino-style daarbij plat, en schuif deze a.h.w. in de huid, oefen daarbij eenigen druk uit. 8". I Wright'sche Bloed-buisje: Houdt „haakvormig" uiteinde (A) aan basis van afvloeienden druppel. Het Duisje zeive Diijit daarbij in horizontalen stand en onder het niveau van den druppel (zie fig.) Door Capillariteit zuigt het buisje van zelf vol C/2—2/3 gevuld is voldoende). Telkens duim stuwen voor het verkrijgen van nieuwe druppels bloed. Is het buisje voldoende vol, zoo wordt het horizontaal neergelegd. met „haak" naar boven. Doe slangetje van duim af, veeg deze met Aether af; het wondje contraheert zich van zelf. 11. Agglutinatie Buisje: Houdt dergelijk buisje eenvoudig met de monding onder den afvloeienden druppel en schep a.h.w. den bloed-druppel er in. 1 ccM. bloed is voldoende; buisje dichtkurken en vertikaal laten stollen. Belemmering van Bloed-aanvoer: Vloeit het bloed niet meer voldoende af, zoo ga men als volgt te werk: Bloed-buisje wordt horizontaal, Agglutinatie-buisje vertikaal ter zijde gesteld. Ontdoe duim van slangetje, beweeg deze enkele malen energisch in het gewricht en appliceer slangetje opnieuw. Helpt dit niet voldoende zoo: Ontdoet men duim van slangetje, zwaai duchtig met den arm, sla daarbij met de hand flink in de lucht, masseer arm van boven naar beneden, en appliceer slangetje opnieuw (zoo noodig opnieuw duim in heet water). Het „dichtsmelten" van het Wright'sche Bloed-buisje: 9°. Houdt ledig gedeelte van bloed-buisje in vlammetje, zoo dat de punt (B) buiten de vlam uitsteekt (om de lucht uit dat gedeelte te doen ontsnappen). Buisje hier vasthouden 10o. Smelt nu uiteinde B plotseling in vlam dicht en laat buisje rustig afkoelen (horizontaal). Zorg vooral dat het bloed nooit warm wordt; houdt buisje daartoe zoo vast, dat altoos de vingers tusschen buisje en vlammetje In zijn; te groote warmte wordt op deze wijze dadeiyk gevoeld. In het „ledige" buisgedeelte is door de verwarming een luchtverdunnlng ontstaan. \\ Door de afkoeling krimpt de nog achtergebleven lucht samen en zuigt de bloed-kolom naar het midden toe, waardoor het „haakvormige" einde vrtf van bloed wordt. 11°. Smelt nu het „haakvormige" uiteinde in de vlam dicht. Het Registreeren der Bloed-buisjes. Teneinde: Naam van den Zieke, Aard der Ziekte, Datum van Bloed-afname enz. nauwkeurig bij het bloedmonster op te geven, ga men als volgt te werk: A. Wright'sche Buisje: Neem stevig stukje papier (bv. dik teekenpapier). Knip er 2 gleufjes in (zie fig.) en vlecht het bloedbuisje a.h.w. door de gleufjes heen. Het papier klemt het buisje voldoende vast. Aanteekeningen kunnen er onder worden aangebracht. B. Agglutinatie-buisje en Wright'sche Buisje; Voorzie buisjes van stukje Kleefpleister (ter hoogte van het bloed-coagulum, niet ter hoogte van het serum; dit voor het latere afhevelen). Plaats er een nummer op met inkt, dat correspondeert met de verdere aanteekeningen. Andere Plaatsen voor Bloed-afname: Oorlelletje: Leent zich bijzonder door zijn bloedrijkheid. Afwrijven met Alcohol en Aether (goed droog wrijven en tusschen duim en wysvinger aanvatten). Met Vaccino-style rand aanprikken en op bovenstaande wijzen bloed opvangen. Hiel: Bij zeer kleine kinderen, bijzonder gunstig. Na huid-desinfectie, precies als boven. Het afzetten en afhevelen van het Serum van het Bloed-coagulum. „Driekantig" Viltje Dunne Glasstaven \ 1 l Pasteur'sche Pipet j Centrifuge. Lang 10 cM. Doorsnede 2 mM. met „stomp" uiteinde zonder Speentje. Het „afzetten" van het Serum. I. Wright'sche Buisje: In de meeste gevallen is de „serum-afzetting" zeer voldoende, toch kan het noodig zijn haar te bespoedigen: Plaats daartoe de buisjes in ledige huls van Centrifuge (coagulum naar onderen) en centrifugeer + 10 min. II. Agglutinatie Buisje: Voor een goede Serum-afzetting is het noodig het Coagulum met „stompe" Glas-staaf van den buiswand rondom los te maken (niet met oogje of naald; kans op aanprikken van het Coagulum, waardoor Serum sanguineus wordt). Zoo noodig centrifugeeren (buisje open) ±10 min. Is het Serum toch Sanguineus, zoo kan dit apart nog eens worden gecentrifugeerd, ter „opheldering". Het „afhevelen" van het Serum. 1- Wright'sche Buisje: Geef even boven het Serum snijdend krasje met vijltje en breek dit buisgedeelte af. I-1I. Wright'sche Buisje en Agglutinatie Buisje: Breng Pasteur'sche Pipet (zonder speentje) in het Serum (prik Coagulum vooral niet aan) en hevel het serum rustig in, door buisje eenvoudig te kantelen, het serum a.h.w. in te schenken. Door de Capillariteit zuigt het serum naar binnen, (gebruik geen „speentje" aan pipet; daardoor kunnen eventueel „luchtbellen" optreden die soms oorzaak zijn dat veel serum verloren gaat). Blaas het serum uit Pasteur'sche Pipet in buisje 1 van „Stam. verd. rekje" (zie pag. 169). Zeer weinig Serum aanwezig: Is er zoo weinig Serum, dat het een „verlies" zou beteekenen, dit eerst in buisje uit te blazen, alvorens het in de Serologische pipet op te nemen, zoo ga men als volgt te werk: Het Serum in de Pasteur'sche Pipet aanwezig, wordt onmiddellijk in de Serologische pipet gebracht, op onderstaande wijze: Nu kan men dadelyk met de reactie als zoodanig beginnen. Ontnemen van Bloed bij het Proefdier (Konijn, cavia). Canule van Injectie-spuit (dun!) Agglutinatie buisje Watten Schaar Alcohol 96 % en Aether (geen Xylol) Meest aangewezen Plaatsen voor Bloed-Afname: 1°. Rand-venen II Voornamelijk de buitenste van het oor || rand-vene (A - zie fig.) 2». Vena Jugularis Arteria Carotis «Dit alleen wanneer groote quantiteiten bloed noodig zijn, b.v. bij „conserveeren" van het Serum. Zie voor Techniek onder „Komplement-Binding". Voorbereiding tot de Bloed-afname. Voor alles noodzakelijk het dier zoo rustig mogelijk te behandelen. Ruw aanvatten, laten schrikken, werken reflectorisch vaatvernauwend. 1°. Laat het dier, desnoods „losjes" in doek geknoopt, rustig op tafel of krukje zitten; zoo min mogelijk vasthouden en ga vlak voor hem zitten. 2». Neem het oor in de hand, haal dit naar voren, zoodat de achterzijde geheel te overzien is en inspecteer de „rand-vene". 3». Is het oor sterk behaard, zoo knipt men voorzichtig de haren af (schaar plat houden) opdat de vene duidelijk te vervolgen is. 4». Wrijf canule van injectiespuit af met Alcohol en Aether (desinfectie) en deponeer deze op „rand"' van tafel, ± de helft over tafel heenstekend. 50. Wrijf vene flink af met Aether (werkt vaatverwüdend, goed droog wrijven, anders vloeit het bloed over de huid uit, inplaats van als druppels af te vloeien. Desnoods Vene bjj den kop nog wat stuwen, door daarop een zekeren druk uit te oefenen. 6o. Schuif Canule in het lumen van het distale einde der Vene (A); houdt deze daartoe plat op het oor en doe haar a.h.w. in de Vene glijden ± 1 cM. 7». Trek de Canule er uit; is deze werkelijk in de Vene geweest, zoo vloeit het bloed onmiddellijk in groote druppels af. 8». Vang het bloed in „Agglutinatie-buisje" op; houdt het oor daarbij naar beneden en stuw de Vene wanneer dit noodig is. Heeft men in plaats van in de vene, er doorheen gestoken, zoo ziet men onder de huid een bloeding ontstaan (vorming van Haematoom.) De Vene wordt geoblitereerd en er kan geen bloed meer afstroomen. Opnieuw punctie, doch nu meer proximaal, om het „haematoom" te ontgaan. Gaat dit niet meer, zoo neme men andere rand-vene. 9o. is voldoende bloed in buisje (+ 1 ccM.) opgevangen, zoo laat men dit vertikaal stollen. 10». Wasch het oor met koud water af (watten), knijp „oor-wondje" tusschen watten dicht, laat „wattenpluksel" er rustig aanhangen (dit valt er later vanzelf af, wanneer het wondje „gesloten" is). Zie voor verdere bewerking van het Bloed pag. 162 enz. De Bloed-afname: Droog Serum : Agglutinatie II. Gedroogd Konijnen-Immuunserum van hoogen titer (1 : 10000—1 : 20000). In den handel in Ampullen verkrijgbaar bij: Sachsisches Serumwerk, Dresdetl. „Driekantig" Vyitje Milligrammen-Balans Agglutinatie-buisje "j Lang 10 ccM. Glas-staaf > zie fig. pag. 162. ƒ Diameter 2 mM. 6 * 6 Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in water) Het Afwegen van het Droge-Serum. 1°. Geef met vijltje snijdend krasje aan kop van Serum-buisje en breek den kop eraf. 2°. Weeg op balans 10 mgr. serum af en doe dit in Agglutinatie-buisje. 3o. Smelt het Serum-buisje in lage vlam geheel toe. (Zorg vooral dat het Serum daarbij niet warm wordt). Het glas van deze „handels-ampullen" laat zich moeielijk in de vlam dichtsmelten; doordat deze Ampullen kort zijn, is het gevaar groot de serumcristallen daarbij te verwarmen. Breng het Serum over in eigen vervaardigde Ampullen: Buigbuis ± 7 mM. diameter met lang uitgetrokken buisgedeelte, zie fig. Zeer gemakkelijk zijn deze Ampullen te openen en zonder gevaar dicht te smelten. Voorzie Ampul van Etiket, waarop naam en titer van het Serum (in donker bewaren). Het Oplossen van het Droge-Serum. 1°. Het gedroogde Serum heeft 10 X zijn gewicht aan vocht verloren. Er moet dus 10 X zooveel vocht worden toegevoegd, om het Serum wederom op normale sterkte te brengen. „Normale" sterkte van het Gedroogde Serum 10 mgr. (V,oo ccM.) Serum, -h 1 /,o ccM. Phys. Zoutsolutie. Het verdient aanbeveling meteen een 10-voudige verdunning van het Serum samen te stellen, er is dan meer vloeistof en het oplossen gaat veel vlugger: 10-voudige Verdunning van het Gedroogde Serum (verd. 1:10) 10 mgr. ('/100 ccM.) Serum + '°/10 ccM. ( 2X5/io«M. \ Phys. \zie pipet pag. 148/ Zoutsolutie. 2o. Los de Serum-cristalletjes zoo goed mogelijk op, door deze met „glas-staafje" tegen den wand van het Agglutinatie-buisje fgn te wrijven, totdat de emulsie homogeen is. Een kort verblijf bij 37° C. kan het oplossen dikwijls bespoedigen. Het verdient steeds aanbeveling het „gedroogde serum" te controleeren met goed agglutinabelen homologen stam of Ficker's diagnosticum, om te zien of het Serum werkelijk den Titer bezit welke op het buisje staat aangegeven. De Bacillen-Suspensie. De Bacillen-Suspensie voor de Agglutinatie-reactie moet van een bepaalde troebeling zijn, wil de uitvlokking op zijn voordeeligst en sterkst te zien zijn. De Suspensie kan bestaan uit: A Levende Bacillen II Men neme steeds een goed agglutlnabele, jonge Agglutinatie I en II || Cultuur (18-24 uur oud). Het meest aan te bevelen: B Doode-Bacillen Ficker's Diagnosticum, bestaande uit „doode" doch tjn | zeer „polyvalente" bacillen (m.a.w. een combinatie " van verschillende goed agglutinabele stammen van dezelfde soort). A. Suspensie van Levende Bacillen in Zoutsolutie J Assii zie nog pag. I53. Olas-staaf 1 }Lang 27 cM. Diameter 2.5 mM. Platina Oogje. 1°. Zorg dat het condenswater niet over de cultuur loopt, deze moet zoo droog mogelijk blijven. Strijk nu met oogje de cultuur van den Agar af, begin onderaan (boven condenswater) en maak lange streken tot boven waar de cultuur eindigt. Dit telkens herhalende, kan men soms de geheele cultuur op eenmaal aan het oogje krijgen. 2». Wrijf nu de cultuur met oogje uit tegen wand van „tulpe", even boven de zoutsolutie, totdat alles goed is fijngewreven. 3». Meng door met „glasstaaf" in buis op en neer te gaan. Laat staaf in „tulpe" staan. 4o. Vul nu bij met Zoutsolutie tot even onder de kurkschijf. 50. Meng opnieuw met glas-staaf; is suspensie te dun (kijk alleen naar dun buisgedeelte), zoo voege men opnieuw Bacillen toe, totdat de juiste concentratie is bereikt. 6. Breng glas-staaf ten slotte in buis met Desinfectans (Creoline). De suspensie moet ongeveer melkwit zien. Aangezien het „dunne" buis-gedeelte der „tulpe" overeenkomt met het lumen der reactie-buisjes, v. R., is de „dikte" der suspensie daarin zeer nauwkeurig te beoordeelen. IDoode bacillen-suspensie van ver- ^ schillende bacterie-soorten in flesch- I [es; in den handel verkrijgbaar bij: ) Agglutinatie I. Merck te Darmstadt, zeer goed | Agglutinabel en Polyvalent. J Bij het gebruik der Reactie-buisjes volgens M. van Riemsdijk (zie pag. 154) verdient het aanbeveling het Ficker's Diag. te verdunnen als volgt: Ficker's Diagnosticum ^ | aa Physiologische Zoutsolutie. ) Macroscopische-Agglutinatie Proef. (Diagnostische, Quantitatieve Methode). Reactie van Widal. Agglutinatie I. Onbekend serum (serum patiënt) + Bekende bacillen. Reactie van Gruber. Agglutinatie u. Bekend serum (Konijnen Immuunserum, gedroogd in den handel) + Onbekende bacillen (Bacillen van patiënt). a Serologische Gegradueerde Pipet Serum pipet (zie pag. 147) Suspensie-pipet („ „ 149) , 1 1 met 12 Buisjes (voor reactie zelve) b' 2 RtkJ" zie pag. 156 van kurk J | met 6 BuIsjes (voor stam.verd.) _ . , ,, II voor het openen van buisje C. „Driekantig» vijltje || met >Fgedroogd.. serum. d. Platina Naald \ "iet te d"n' ,v00r f mengen J der reactie als zoodanig. Utensiliën: Platina Oogje } voor het maken der Suspensie. In reageer- ( Behoeft "1 e. Physiologische Zoutsolutie. buizen of I niet steriel I Hoog (0.85 % NaCI in water) kolfje te zjjn j vullen. ƒ. Tulpe van Muller \ _ „ ' > voor Bacillen-Suspensie Zie fig. pag. 153 ƒ F g. Dunne glas-staven 1 Lang 27 cM. | ? Diameter 2H mM. J voor het mengen der suspensie zie pag. 166. h. Reageerbuis met Creoline oploss. (hoog vullen). De Bacillen-Suspensie. A. Ficker's i Diagnosticum. (Lang houdbaar) ' Doode bacillen, in den handel verkrijgbaar, zie pag. 167. j Agglutinatie I. Ficker's Diagnosticum + hysiologische Zoutsolutie in Tulpe schenken u I aa Voor Buisjes volgens M. van Riemsdijk pag. 154. B. Suspensie van levende bacillen in Zoutsolutie:| Ag^1"^n^tie ,Jonge" culturen (18-24 uur) suspendeeren in Tulpe van Muller (zie voor Techniek pag. 166). De suspensie moet ongeveer melkwit zien. Het Serum. Vloeibaar Serum (van patiënt of van proefdier) Agglutinatie I. Versch ontnomen, niet sanguineus. II Pipetdeeltje voor 2 Agglut. 2H „ 5 Zie voor Tenhniek der Bloedafname pag. 159-163. Droog Serum: van hoogen Titer, (zie pag. 165) Agglutinatie II. 10 mgr. (i/]00 ccm.) Serum ■+■ ,0/ ccm. ( 2XS/iOccm' \ Phys. '10 V zie pipet pag. 148 ) Zoutsolutie verd. 1 :10 voor minstens 5 Agglutinaties Serum goed oplossen, zie voor Techniek pag. 165. De emulsie moet homogeen zien. Principe der Serum-verdunningen: In ieder buisje komt {1 Pipet-deeltje der Serum-verd. + 9 Pipet-deeltjes der Bacillen-Suspensie , Totale | Serum' verd. Ieder Serum-deeltje (eigenlijke serumverdunning) wordt dus door de bacillen-suspensie 10 X verdund (1+9 deeltjes = Totale Serumverd.). Voor het berekenen der Eigenlijke Serum-verdunningen, moet dus ieder Totaal verdunningsgetal door 10 worden gedeeld, om te weten hoe of iedere Eigenlijke serum-verdunning moet worden samengesteld. Voorbeeld van totale Serum-verdunning 1 :100. Het Eigenlijke verdunningsgetal = 100:10 = 10. Het Serum-deeltje moet dus 10 X worden verdund (1 dl. serum + 9 dl. zoutsolutie). 1 deeltje van de verdunning 1:10 +9 (keltjes Bacillensuspensie is dus verdunning 1 :100. Het verdient aanbeveling dit Eigenlijke verdunningsgetal steeds onder het Totale verdunningsgetal te plaatsen b.v.: 1 : 100 Totale verd.; 1 : 10 = Eigenl. verd. Voor den aanvang van iedere reactie maakt men dus eerst een schema van de opvolgende Totale Serumverdunningen met daaronder de opvolgende Eigenlijke Serumverdunningen. Schema der Serum-verdunningen. Totale Contr. 1:50 1:100 1:250-1:500 1:1000 1:2500-1:5000 1:10000-1:20000 Serum-verd. q fetp9) S"s"; Serum-verd. Eigenlijke 1:5-1:10 1:25-1:50 1:100 1:250-1:500 1:1000-1:2000 Uit de eigenlijke Serum-verdunningen worden nu z.g. stam-verdunningen samengesteld, die op Rekje II worden aangebracht en van waaruit alle eigenlijke Serumverd. worden bediend, als volgt: Voorbeeld: 2 Deeltjes van Stam-verd. 1 :10 = 1:5 (-(- 9 DL Bac. Susp. = 1:50 ) 2 1 :50 = 1:25 (+ 9 DL Bac. Susp. = 1:250) enz. enz. zie fig. Techniek der Serum-verdunningen. De Stam-verdunningen. Neem de „gegradueerde Pipet" uit den Alcohol, spoel met water door, (zie pag. 149 onder I, II, III) en vervaardig de volgende „Stamverdunningen li 10 Voldoende voor 5 reacties. 1:10 1:50 1:100 1:500 1:2000 22K DL 16 DL 18 DL 20 DL 15 DL 1* z z z z z ii "h + + + + 2H DL 4 DL 2 DL 5 DL 5 DL Ser. Ser. Ser. Ser. Ser. 1 : 10 1:10 1 :100 1:500 Voorbeeld van verdunning 1:10. 1°. Reinig pipet en spoel dezen uit als onder I, II, III, pag. 149. 2°. Laat eenige deeltjes vloeibaar of opgelost serum opglijden (zie V-VI, pag. 150). 3°. Laat daarvan 1 Deeltje in Buis 1 :10 uitloopen (zie fig.) en blaas het overige Serum in het oorspronkelijke buisje terug. 4°. Spoel pipet uit (zie I, II, III pag. 149). 5°. Voeg 9 Deeltjes Physiologische Zoutsolutie toe (VII pag. 151). Hevel daartoe 10 deeltjes in de Pipet en Iaat tot 1 uitloopen. 6°. Reinig pipet (zie I, II, III pag. 149). Maak de overige „Stam"-verdunningen precies op dezelfde wijze zooals het schema aangeeft. De Totale-verdunningen. 7°. Uit de Sta/re-verdunningen worden nu de Totale-verdunningen samengesteld, door telkens 1 a 2 deeltjes der bepaalde Stam-verd. over te brengen in de Buisjes van Rekje I (zie pag. 169) en daaraan later de 9 deeltjes Bacillen-Suspensie toe te voegen als onderstaand schema aangeeft. „.„Telkens P'Pet £oed spoelen Uisschen Het overbrengen van iedere „nieuwe" stam-serumverdunning. """ Men drage zorg nooit meer dan hoogstens 2 serumdeeltjes in de buisjes van Rekje 1 te doen (zie verd. 1:50 — 1:250 — 1:2500 enz.) er wordt daardoor wel een heel kleine fout gemaakt, deze is echter zoo uiterst gering, dat zij praktisch geen waarde heeft. (Anders zoude het zijn, als men bv. voor serumverd. 1:10, 10 deeltjes van stam-verd. 1:100 zoude nemen). Het spreekt wel vanzelf dat tusschen de verd. 1 : 50 -1:100 — 1 :250 1:500 — 1:2500 - 1:5000 — 1:10000-1:20000 niet telkens behoeft gespoeld te worden, daar zij telkens uit dezelfde stamverdunning worden geput (zie pag. 169). Men doet goed hier telkens de verdunningen voor beide buisjes tegelijk in pipet te nemen. Het verdient aanbeveling de hoeveelheid, welke beantwoordt aan de capillariteit der pipet (b.v. 1 deeltje), boven de benoodigde hoeveelheid serum in de pipet te hevelen, men behoeft dan nooit uit te blazen. Het toevoegen der Bacillen-Suspensies Oebruik hier de „Suspensie"-Pipet (pag. 49). Men overtuige zich eerst dat gewoon water gemakkelijk door de Pipet heenglijdt. 8°. Laat nu in ieder buisje 9 pipetdeelen bacillen-suspensie uit Tulpe vloeien. Diameter 20 mM. „Tulpe" Diametei 9 mM. Houdt „Tulpe" vertikaal in de hand (dunne einde), zoo dat de „kurk" naar achterwand is gericht. Laat pipet volloopen en laat deze bij het uitnemen, langs de kurkschjjf glyden (voor het „afvegen" van het aanklevende vocht) zie nog pag. 163. Desinfectie Tulpe en Pipet. Na afloop laat mpn Pipet in Tulpe staan; giet in Tulpe Creoline-oplosslng (bovenaan toe). Laat pipet er (met caoutchouc) + 1 uur in staan. Goed spoelen onder waterstraal. in Tulpe gieten Zoutzuren-Alcohol (gefiltreerd! zie pag. 24), Pipet daar ook in laten staan, totdat beide buizen volkomen rein zijn. Het verdient aanbeveling het „Ficker'sche Diagnosticum", na schudden ook in Tulpe te schenken, de suspensie is dan homogener; in het fleschje blijft er zoo licht wat op den bodem. 9°. Meng Suspensie + Serumdeeltje(s) door met platina naald in de buisjes te roeren, te beginnen met het achterste (10) en zoo op te klimmen tot buisje 2. Werk de „luchtbellen" daarbij tevens naar boven. Dit om te vermijden dat de naald telkens moet worden uitgegloeid; de fractie serum welke van de „zwakkere" verd. in de „sterkere" wordt overgebracht, is van geen beteekenis. Men denke er echter wel aan, tusschen buisje 2 en de controle de naald wel uit te gloeien, anders wordt het controlebuisje met Serum besmet. 10°. Plaats de proef in broedstoof 37° C. 15 a 30 min. Sommige Bacterien eischen een langeren incubatie-tijd en hoogere temperatuur. (Coli-Dysenterie-Meningokokken). Zie daarvoor de specialistische Handboeken. Buisjes dichtkurken, wanneer zij bij hoogere temp. moeten verblijven (om verdamping te voorkomen). Het aflezen der Agglutinatie-proef: 11°. Bekijk de buisjes, door het rekje naar het licht toe te houden. Het bekijken met een loupe kan wenschelijk zijn (dit bij den aanvang en bij zwakke reactie). Laat de proef nu bij kamer-temperatuur staan en bekijk opnieuw na 24 uur. Na afloop der proef, denke men bij het desinfecteeren der buisjes (zie pag. 155), de Creoline-oplossing goed met het sediment te mengen (platina-naald), anders blijft het „stijve" sediment in punt en komt de Creoline er niet voldoende mede in aanraking. Zie voor „interpretatie" der resultaten pag. 174 enz. Bij de agglutinatie reactie kan men 3 mogelijkheden verwachten: A. Er treedt agglutinatie op: Homogene suspensie geen Agglutinatie. Zoutsolutie ■j- bacillen (Controle) Serum + bacillen Vlokvorming Agglutinatie. B. Er treedt „geen" agglutinatie op: Homogene suspensie geen Agglutinatie. Zoutsolutie + bacillen (Contróle) Serum | + bacillen j Homogene suspensie = geen Agglutinatie. C. Er treedt „Auto" (spontane, pseudo) agglutinatie op: Vlokvorming „Auto" Agglutinatie. Zoutsol. ~t~ bacillen (Contr.) Serum + bacillen Vlokvorming „Auto" Agglutinatie. Bij het optreden van een „spontane" (Auto) agglutinatie is de proef diagnostisch waardeloos. Theorie der „Quantitatieve" Agglutinatie Reactie. De Agglutinatie vertoont zich bij deze methode als een FIJNE vlokvorming, gelijkende op een sneeuwbui, die naarmate de serum-concentratie zwakker wordt, ook steeds fijner en onduidelijker wordt. Na langer staan, zakken de vlokjes uit, zoodat op den bodem een wit bezinksel ligt, met daarboven een veel helderder vloeistof; dit noemt men „Clarificatie". Voor de reactie van Widal, vooral in den aanvang der ziekte, heeft men nooit een zeer hoogen titergrens van het serum te verwachten; een verdunning tot 1; 1000 — 1:2500 is doorgaans ruim voldoende. Bij de Agglutinatie-Reactie lette men op volgende bijzonderheden: Het „Tijdsverloop" waarin de Reactie optreedt. Van groot belang is het op het tijdsverloop te letten waarin en tot welke serum-verdunning de reactie optreedt. Het snellere of langzamere optreden der reactie, bij tegelijk aangestelde proeven tusschen „verwante" organismen (Typhus — Para-Typhus) kan dikwijls een duidelijke aanwijzing geven, welke ten gunste kan uitvallen van het organisme, dat het eerst en het krachtigst de reactie vertoont. (Specifieke agglutininen). Dit reactie-verschil, dat in den aanvang optreedt, kan dikwijls na enkele uren geheel genivelleerd (ingehaald) worden, zoo dat zich het omgekeerde beeld kan gaan ontvouwen. Voorbeeld: Na 30 min. na 4 uur. Serum X + Typh. Bac. 1:1000 + 1:2500 + „ „ -} Para Typh. A. Bac. 1: 250 + 1 :2500 -J- Uitschakelen van „Groep"- of „mede" Agglutinaties. Bacteriën welke biologisch „verwant" zijn (Typhus-Coligroep; Dysenterie groep; Vibrionen-groep enz.) vertoonen deze verwantschap ook „serologisch". Een Typhus-serum heeft weliswaar in hoofdzaak agglutininen voor Typhus Bac. („hoofd-agglutininen"), doch ook agglutininen welke de „aanverwante" organ. tot uitvlokking kunnen brengen („bij" agglutininen). De laatste zijn echter minder in aantal, zoodat de titer van de „mee" agglutinatie meestal achterblijft bij dien der „hoofd" agglutinatie. Voorbeeld: 1:50 - 1:100 - 1:250 - 1:500 - 1 :1000 - 1 :2500 enz. Serum X + Typh. Bac. ++-++-++-++ - + - (+) n • -h P.Typh.A „ ++-++- — - — - — - — „ „ ± P.Typh.B „ _ Hieruit blijkt de noodzakelijkheid om de reactie altoos op te voeren tot den „titergrens" van het serum (n.m. de kleinst mogelijke serum concentratie, waarbij nog agglutinatie met den „homologen" stam optreedt). Bij „Meng-Infectie" (bv. van Typhus en P. Typh. A. tegelijk) kan de agglutinatie voor beide organ. gelijk hoog zijn (2-hoofd agglutininen), dit in tegenstelling met de „mee-agglutinatie" (zie nog Proef van Castellani). De „Remming" of het verschijnsel van Neisser-Wechsberg: Bij sommige reacties, lang niet bij alle, vertoont zich volgende eigenaardigheid: De Agglutinatie is bij zwakkere serum-concentratie sterker dan bij sterkere „ » Voorbeeld: Serum X 1:50 - 1:100 - 1:250 - 1:500 - 1:1000 enz. Typh. Bac. — - — - + - ++-+ + Deze „negatieve phase", welke dus optreedt bij een overmaat van het antilichaam (serum) vindt waarschijnlijk haar grondslag hierin, dat naast de Agglutininen, „stoffen" voorkomen (Agglutinoïden! „Schutz-colloïden"!) welke antagonistisch werken, het „Bacterie-serum" complex a.h.w. onbeïnvloedbaar maken voor het uitvlokkend beginsel van het.Electrolyt (zie nog pag. 80 enz.). Bij een dergelijk verloop der reactie bestaat er dus een „optimale zone" voor de Agglutinine-werking, gelegen bij de „zwakkere" serum-concentraties, aangezien daar de „remmende" stoffen voldoende zijn verdund, dat de Agglutininen als zoodanig „ongeremd" haar werking kunnen ontvouwen. De „grootte" der Vlokken. a. „grove" vlokvorming. Te onderscheiden zijn: jf.jne„ vlokvorming. Voorbeeld: Typhus-achtigen = „fijn-* vlokkig. Dysenterie- „ = „grof" „ Proteus- = „grof" „ (vlokken rangschikken zich „laags-gewijze".) Over de wijziging der vlokvorming van „grof" tot „fijn" en omgekeerd bij hetzelfde „Bacterie-serum complex" door verwarming (Thermolabiele-Thermostabiele receptoren), zie men de specialistische handboeken. De „In" Agglutinabiliteit. Treedt geen agglutinatie op, zoo zijn hiervoor 2 oorzaken: a. Of de Bact. vinden in het serum geen passende receptoren (Agglutininen). b. Of „ „ „ „ „ wel „ „ .. doch het „complex" kan niet uitvlokken. De oorzaak van b. kan zijn: jo. Bacteriën direct afkomstig uit het dierlijk lichaam, kunnen, doordat zij daar gedurig contact hebben gehad met de zich vormende Immuun-stoffen, later tegenover specifiek serum hun Agglutinabiliteit hebben ingeboet (zoowel „binding" als „uitvlokking", zie pag. 80 enz). Het is n.m. bewezen dat Typh. Bac. in tegenwoordigheid van Imm. Serum gekweekt, hun Agglutinabiliteit langzaam verliezen. Herhaalde overentingen zijn dus noodig om de agglutinabiliteit te herstellen. 2». Bacteriën van specifieke voedingsbodem (Endo-plaat; Dieudonné-plaat, enz.) kunnen, onder invloed van den voedingsbodem, hun agglutinabiliteit tijdelijk hebben verloren. De „binding" van het„agglutinin" kan echter toch plaats hebben gehad. Enkele„passages" op gewonen Agar doen de „uitvlokking" terugkeeren. 30. Het Serum kan ook oorzaak zijn; hier kunnen de Agglutininen zich hebben omgevormd (Agglutinoïden! enz.). Deze worden nog wel „gebonden"; het „complex" laat zich echter niet meer „uitvlokken" (zie pag. 80 enz.). De „binding" kan hier indirect door de „Complement-bindingsreactie" worden aangetoond (zie later). Zie voor de Theorie van het „Uitvlokklngs-proces" pag. 180. De „Quantitatieve" Agglutinatie-reactie alleen of in combinatie met de Proef van Castellani (zie pag. 184), is dus alleen instaat, door het uitschakelen van „mede" of „groep" agglutinaties, infectieziekten serologisch juist te diagnostiseeren. Microscopische Agglutinatieproef. (Oriënteerende — Qualitatieve methode). a. Gegradueerde serologische pipet van 10 deelen (zie pag. 147). b. „HoP'geslepen objectglazen. C. Dekglazen 18 mM, □ d. Vaseline. e. Platina naald en oogje. f. Physiologische Zoutsolutie, (0.85 % NaCl in water). g. Cultuur ƒ Colonie van plaat l of | Goed agglutineerbare Reincultuur ] ( 24 uur oude agar-cultuur. | v \ Ficker's Diagnosticum J J | Agglutinatie II. > Agglutinatie I. h. Serum ( Serum patiënt (zie pag. 158) of 10 mGr. Konijnen-Immuunserum (droog) ^ van hoogen titer (zie pag. 165) ! Agglutinatie I. [ Agglutinatie II. Techniek der Methode. 1°. Maak van serum een verdunning 1 :100. Eerst verd.1:10 1 deeltje vloeibaar serum + 9 deeltjes Zoutsolutie of 10 mgr. droog serum ■+* ,0/l0 ccM- (zie ^pet'pag^us) Zoutsolutie Vervolgens hiervan 1 deeltje + 9 deeltjes Zoutsolutie == Verd. 1:100. 2°. Maak nu een gewoon „hangende druppeF' praeparaat (zie pag. 61) en rangschik de druppels op de volgende wijze: a. Leg met uitgegloeid oogje eerst een druppel zoutsolutie op het dekglas. b. Leg daarnaast met uitgegloeid oogje een druppel serum 1:100 op het dekglas. Serum 1:100 Zoutsolutie (contrêle) 3°. Neem nu met uitgegloeide, afgekoelde naald een weinig cultuur en laat er een vlokje van uitvloeien: a. in druppel Z0uts0lutie\ Nooit andersom, daar de zoutsolutie anders rr J. met serum besmet wordt en de proef daardoor b. „ „ serum J waardeloos wordt. Heeft men als materiaal plaat-colonies (Agglut. II) dan gebruikt men altijd I colonie voor beide druppels, anders is er geen zuivere vergelijking tusschen contröle en serumdruppel mogelijk. 4°. Gloei naald uit en laat afkoelen. 5°. Meng nu de bacteriën met de naald gelijkmatig door de druppels heen: a. eerst door den zoutsolutie druppel l 71 oae 61 punt 7" b. dan „ „ serum „ ) v B' 6°. Sluit dekglas in als onder punt 9—10, pag. 61. 7°.a. Bekijk het praeparaat macroscopisch (met loupe, desnoods met afgeschroefde frontlens van oculair). b. Bekijk het praeparaat «z/croscopisch (zie pag. 63) stel hier eerst den contröle-druppel in (zoutsolutie en bacillen); men draaie nu daarna niet het objectief omhoog, maar verschuive het objectglas, terwyl men door oculair ziet, onder het objectief door, naar den serumdruppel toe, die in de meeste gevallen dan ook tevens is ingesteld. Indien de agglutinatie in + 10 min. niet duidelijk zichtbaar is, is het wenschelijk het praeparaat voor 5 a 10 min. in de broedstoof van 37° C. te plaatsen; de druppels zullen niet indrogen, mits de vaseline het dekglas overal goed afsluit. Theorie der „Qualitatieve" Agglutinatie Methode. 1°. Het optreden van „Agglutinatie" laat zich door middel van deze methode dikwijls al op tweeërlei wijzen vaststellen; A. Macroscopisch aspect van Serum en Zoutsolutie-druppel De bacteriën laten zich moeielijk met het; Immuunserum vermengen = Vlokjes-vorming (agglutinatie) De bacteriën.laten zich gemakkelijk met de zoutsolutie vermengen = Homogene-suspensie (contröle). Agglutinatie. | Serum | bacillen Zoutsolutie + bacillen I Contröle. I Geen I Agglutinatie. Deze reactie treedt al dikwijls op, wanneer men bezig is het bacteriënmateriaal in de druppels te verdeelen. Dit „macroscopische" verschijnsel der „microscopische agglutinatieproef" vertoont zich lang niet constant, ook dikwijls niet wanneer de agglutinatie microscopisch toch duidelijk positief is. Zij treedt alleen dan op, wanneer het Immuunserum bijzonder werkzaam en krachtig is. B. Microscopisch De bacteriën in het Immuunserum ver- ï Serun?°enVZout- t00nen een „hoopjes"vorming, en ver- > Agglutinatie, solutie-druppel lies van iedere beweging. J De bacteriën in de Zoutsolutie vertoonen \ Contröle hetzij een Eigenbeweging, hei zij een > Geen Brown'sche moleculair beweging. ' Agglutinatie Agglutinatie. Contröle (geen Agglutinatie). 2°. Indien geen Agglutinatie optreedt, vertoont zich het volgende: Bacteriën in het serum vertoonen Eigenbeweging of Brown'sche moleculair beweging. Bacteriën in de zoutsolutie vertoonen Eigenbeweging of Brown'sche moleculair beweging. Geen Agglutinatie Imm. Serum + bacillen Zoutsolutie *+- bacillen Contröle. Geen Agglutinatie. 3°. Indien „Auto" (spontane) Agglutinatie optreedt vertoont zich het volgende: Bacteriën in het serum vertoonen „hoopjesvorming" en verlies van elke beweging. Bacteriën in de zoutsolutie vertoonen „hoopjesvorming" en verlies van elke beweging. „Auto" Agglutinatie Imm. Serum ■f" bacillen Zoutsolutie 4~ bacillen (Controle) „Auto'* Agglutinatie. Men vergete NOOIT den „Contröle"-druppel, daar anders de proef WAARDELOOS wordt. Het is wenschelijk de serum-concentratie bij deze proef nooit sterker te nemen dan 1:100; bij 1:50 heeft men kans dat de „normaal-agglutininen" een rol kunnen gaan spelen, die dan de proef zeer in waarde doen verliezen. De qualitatieve Agglutinatie-proef laat zich alleen gebruiken: A. Bij uiterst weinig bacteriën-materiaal (colonietje van plaat). B. Als „oriënteerende" proef, om te zien of er al dan niet Agglutinatie („groep" Agglutinatie) optreedt. Grootere diagnostische waarde mag men aan deze methode nooit hechten. Voor het serologisch diagnostiseeren van micro-organismen, het uitsluiten van „groep"- of „mede" agglutinaties, is alleen de „quantitatieve" agglutinatie-proef (soms in combinatie met de Proef van Castellani) te gebruiken (zie pag. 167). Theorie van het „Uitvlokkings" Proces x). Stoffen welke bij de Immuniteits-reacties de „specifieke" rol spelen (AgglutininenPraecipitinen - Lysinen - Toxinen - enz.) behooren tot de „Colloïden". De Agglutinatie-reactie als zoodanig, behoort dan ook tot de „colloïd-chemische" reacties. Kort begrip der Colloïden. „Colloid = „Colla" (lijm). Onderstaand schema geeft de plaats aan der „Colloïden" in het „physischoptische" Systeem. Dispersie Systemen. A. Grove Dispersie. Deeltjes grooter dan '/10000 mM. (öTïT) Gaan niet door papieren Filter Diffundeerennietdoor3"/ugelatine Dialyseeren niet In „gewoon" microsc. zichtbaar In „ultra" „ zichtbaar B. Colloïden. Deeltjes van '/ioooo—Vioooooo mM- (0.1 u) — (1 uu) Gaan wel door papieren Filter (mits gestoord door adsorbtie). Diffundeeren niet of zeer weinig door 3 % gelatine. Dialyseeren niet, of uiterst langzaam In „gewoon" microsc. onzichtbaar In „ultra" „ zichtbaar C. Moleculaire Dispersie. (Echte oplossing). Deeltjes kleiner dan Vioooooo mM(1 uu) Gaan wel door papieren Filter Diffundeeren wel door3% gelatine Dialyseeren wel In „gewoon" microsc. onzichtb. In „ultra" „ onzichtb. De Dispersie graad neemt toe van A tot C. Dispersie = Gelijkmatige verdeeling van een stof in een andere stof Disperse Phase = Stof welke verdeeld wordt. Dispersie middel = Stof waarin de disperse-phase verdeeld wordt. I Hoe grooter de dispersie [ hoe „sterker" de verdee! ling, hoe „kleiner" de afzonderlijke deeltjes. C. het kleinst. 1) R. Höber, Physikalische Chemie der Zelle & der Gewebe 1914—1922. Verlag Engelmann, Leipzig. W. J. Tulloch. A Study of the mechanism of the Agglutination & Absorption of Agglutinin Reaction etc. etc. — Journ. of Hygiene vol XVII 1918. J. Bordet. Traité de 1'Immunité 1920. Masson & Co. Paris. H. Handovsky. Grundbegriffe der Colloïd Chemie 1923. Verlag Julius Spinger, Berlin. H. Netter. Klinische Wochenschrift No. 49. 1924. Bij de Agglutinatie-Reactie werken 3 stoffen op elkaar: lo. Antigeen (Bacteriën) 2°. Antilichaam (Serum) 3». Suspensie-vloeistof (Zoutsolutie) De Reactie als zoodanig verloopt in 2 Phasen (Bordet). Phase I = Binding van Antigeen (Bact.) + Antilichaam (Serum) Phase I! = Uitvlokking van het „Antigeen-Antilich. Complex" onder invloed van Electrolyten (zouten). De Bacteriën blijven in de vloeistof gesuspendeerd, omdat zij evenals de deeltjes van elke Colloïdale oplossing een Electrische-lading hebben. Wordt door een „Colloïdale oplossing" een Electr. stroom gevoerd zoo gaan: Sommige Colloïden naar de positieve pool, deze zijn negatief geladen! Electro»» *» n n negatieve „ „ „ positief „ ƒ phorese De „lading" van de Colloïdale deeltjes wordt direct bepaald door de „lading" (Electr. dissociatie, Kat- en Anionen) van de vloeistof waarin deze zijn gesuspendeerd, m.a. w.: Worden meer K^ationen uit de vloeistof geadsorbeerd, zoo wordt de lading der deeltjes positief „ meer Anionen „ „ „ „ „ wordt de lading der deeltjes negatief Dit is veranderlik en omkeerbaar, al naar de Electrolyten van de vloeistof, hoe deze zijn gedissocieerd, en welk „Ion" bij voorkeur door de „deeltjes" wordt geadsorbeerd (adsorbtie vermogen). Is de vloeistof Water (positief) zoo zijn de deeltjes negatief geladen. h „ n Water + Alkali( „ )„ „ „ „ negatief n n n Water + Zuur (negatief) „ ' „ „ „ positief „ De z.g. „omlading" van positief tot negatief (en omgekeerd) gaat over het Iso-electrische (neutrale) punt heen, waar geen lading bestaat. Bacteriën (zelf Electro-Amphoter) in Zoutsolutie krijgen dus een „negatieve" lading, daar de vloeistof „positief" geladen is. Aangezien de „deeltjes" (bact,) alle van gelijke „lading" zijn, stooten z\j elkander aan alle zijden af, en blijven daardoor in zwevenden toestand (geen samenklomping) „stabiel". Phase I: Binding van Bacteriën + Serum. Bij de Agglutinatie-reactie wordt een vreemde stof (serum) gebracht in een 2 Phasisch systeem (Bact. -f Zoutsolutie). De hoeveelheid van een vreemde substantie, welke door een „disperse phase" geadsorbeerd kan worden, hangt o.a. af van de oppervlakte die de vreemde stof geboden wordt om zich op vast te hechten (oppervlakte spanning), van de Electrische lading enz. m.a.w. van de physisch-chemische affiniteiten. Het Serum verdeelt zich nu tusschen de Zoutsolutie en de Bacteriën; wordt een voldoende groote Bacterie-oppervlakte, van de juiste physisch-chemische samenstelling (homoloog) geboden, zoo zal het geheele serum (al de Agglutininen) daarop condenseeren. Is de oppervlakte niet groot genoeg, zoo zal een gedeelte van de Agglutininen ongebonden blijven; deze kunnen wederom worden aangetoond in de bovenstaande vloeistof, wanneer „Antigeen-Antilichaam complex" wordt afgecentrifugeerd. Het „homoloog" zijn van Serum tot Bacteriën is juist het „specifieke" (biologische!) doch onverklaarbare in deze reacties. Een niet „specifieke" binding met heteroloog antigeen kan tot op zekere hoogte ook plaats vinden (denk aan „groep" of „mede" agglutinaties, zie pag. 175). Een juiste H-Ionen-concentratie (reactie der vloeistof) is van groot belang voor het tot stand komen van de „binding" (n.m. „neutraal"). Zoo kan het vooraf verwarmen van het Antigeen (Bact. Suspensie), door wijziging van den Colloïdalen toestand, de „binding" bespoedigen (Diphtherie Proteus - Kapselbacteriën enz). Phase II: De „uitvlokking" van het Bacterie-Serum-„complex". II Vlokken eerst uit bij toevoeging van Electrolyten in Hooge concentratie, gelijken daardoor | op gewone Proteïnen. (II Vlokken reeds uit bij toevoeBact. suspensie\ ging van Electrolyten (zouten) + ) in lage concentratie, gelijken Spec. Serum ' daardoor op „gedenatureerde" I' Proteïnen. Hoe komt het nu, dat de Bacterie-suspensie, welke eerst „stabiel" is, plotseling „instabiel" wordt en gaat „uitvlokken", wanneer daaraan het „specifieke" serum wordt toegevoegd? Bordet toonde aan, wanneer het Zout (Electrolyt) uit de vloeistof wordt weggelaten, de „uitvlokking" uitblyft, de „binding" van het Agglutinine echter blijft bestaan (Agglutininen uit vloeistof verdwenen, wanneer Bact. worden afgecentrifugeerd.) Het Electrolyt (hier NaCl) is dus voor de uitvlokking beslissend. Schema > Bact. + water + NaCl = Homogene suspensie (stabiel) Bact. + water + Imm. ser. = Binding Agglut. geen uitvlokking (stabiel) Bact. + water 4 Imm. ser. + NaCl = „ „ wel „ (instabiel) Het Immuun-Serum moet dus op eenigerlei wijze het bestaande colloïd-chemische evenwicht wijzigen. Bordet legt het zwaartepunt in den Bacterie-wand als zoodanig (Ektoplasma). Hierin zouden z.g. „Schutz-colloïden" voorkomen, die het cel-lichaam a.h.w. beschutten voor het uitvlokkend beginsel van het Electrolyt. Het Imm.-ser., dat zich door adsorbtie op het cel-lichaam vasthecht, zou nu deze „beschuttende laag" te niet doen (om-vormen); er ontstaat een ander „complex , het Electrolyt wordt niet meer in zijn werking tegengehouden en kan nu gaan „uitvlokken". Höber, die de Bacteriën (protoplasma) tot de „hydrophiel" colloïden rekent (moeilfjk uitvlokbaarl neemt aan dat de adsorbtie van het Agglutinine het „hydrophiel" \Electrolyt ongevoelig) . „ -j j ^ ƒ gemakkelijk uitvlokbaar 1 colloïd in „Suspensie" („hydrophob ) colloïd verandert | Electrolyt gevoelig Het Imm. ser. schept dus blijkbaar andere Colloïd-chemische verhoudingen, er ontstaat een veel „labieler", Electrolyt-gevoeliger evenwicht. Hoe sterker de bacteriën zich met Agglutininen beladen, (hoe meer agglut. het ser. dus bevat) des te Electrolyt-gevoeliger wordt het „Complex", des te minder van het Zout is er noodig om de uitvlokking tot stand te brengen, dit gaat parallel. De „omvormingen" aan de Bacterie-oppervlakte, door de inwerking van het Imm.-ser. brengen dus het „Complex" dichter bij het „Iso-electrische" (neutrale) punt (Electr. lading het „zwakst"; „labiliteit" het grootst, gemakkelyk uitvlokbaar) zie pag. 181). Hoe „stabieler" een suspensie, hoe sterker de Electr. lading en omgekeerd. Handin[hand met de „daling" der Electr. lading, neemt meestal de „oppervlakte spanning" toe en daarmede de neiging der „deeltjes" om zich tegen elkaar aan te leggen (en omgekeerd). De „uitvlokking" als zoodanig moet men zich nu als volgt voorstellen ï (Höber-Handovsky enz.) Het Electrolyt verstoort nu a.h.w. dit „labiel" geworden colloïd-chemische evenwicht, door de „zwakke" lading der deeltjes te neutraliseeren, de „disperse phase" te ontladen. De „deeltjes" stooten elkaar niet meer af, doch trekken elkaar aan, zij vallen tot klompjes samen, de „uitvlokking" (agglutinatie) is er. Het Kat-ion van het Electrolyt is hier dus het „actieve" bestanddeel, omdat de „deeltjes" negatief geladen zijn. .. r» . Positieve Colloïden worden uitgevlokt door Atlionetl Algemeene Regel: 6 Negatieve » * Kationen Alle stoffen nu, die deze „ontlading" kunnen bewerken, vlokken uit; dit deel der Reactie (Phase II) is dus geheel onspecifiek en secundair. Zelfs behoeft het Imm. serum daarvoor niet eerst te hebben ingewerkt; b.v. Agglutinatie door Zuren „ „ Kleurstoffen „ „ Ijzer-zouten „ „ Sublimaat „ „ Formaline enz. enz. is waarschijnlijk ook toe te schrijven aan een dergelijke „ionen"-verschuiving, die „ontladend" werkt en daardoor „uitvlokt", hoewel het hier evengoed mogelijk is, dat het reagens het Bact.plasma-oppervlak eerst zoo physisch-chemisch omvormt, dat het bepaalde tegengestelde Ion de „ontlading" kan bewerken. Alle stoffen welke de „ontlading;; tegengaan, remmen dus de uitvlokking (schutzcolloïden-Agglutinoïden, zie pag. 176). De „Auto" of „Spontane" Agglutinatie: Het verschijnsel dat bacteriën reeds in Zoutsolutie, zonder meer, een „samenklomping" kunnen vertoonen (Diphtherie enz.) zou zijn verklaring dan moeten vinden, om bij Bordet's hypothese te blijven, in een niet voldoende „beschuttende laag", om met Höber te spreken, dat het cel-lichaam reeds meer op een Suspensiecolloïd gelijkt. De juist gebalanceerde verhouding tusschen cel-lichaam en zout is niet meer aanwezig; een „verlaging" van de Zout-concentratie kan hier inderdaad de „spontane" uitvlokking opheffen. Invloed van de Temperatuur op de „uitvlokking". De temperatuur is van invloed door: a. Het veroorzaken van een permanente beweging der vloeistof; voorzichtig schudden verhaast n.m. de „uitvlokking". Dit brengt de [deeltjes nader tot elkaar. Bij 55° C. is een sterker strooming in de vloeistof dan bij 37° C. b. Door verandering der physische constellatie, waardoor de „uitvlokking" door het Electrolyt geactiveerd of geremd wordt. Voorbeeld: Coli -f- Imm. Serum vlokt uit bij 37° C. ZWClk, bij 55° C. sterk Meningoc. + Imm. Serum „ „ „ 370C. ZWak) bij 55« C. sterk *,Snelheid" van de uitvlokking. De „uitvlokking" verloopt in 3 stadia: Stadium I = zeer langzaam begin der uitvlokking' „ II = sterke versnelling, welke een tijd aanhoudt. „ III = vermindering tot 0. Summa Summarum. Uit het voorgaande blijkt dus dat: De „Binding" (Phase I) het „specifieke" deel der Agglutinatie is, terwijl De „Uitvlokking" (Phase II) bewerkt kan worden, niet alleen door NaCl, doch door alle stoffen welke de „ontlading" der deeltjes kunnen bewerken (niet specifiek). De Agglutinatie-reactie bestaat dus, zooals iedere „uitvlokkings" reactie uit een reeks fjjn gebalanceerde physisch-chemische constellaties, welke tot elkaar in een bepaald evenwicht moeten staan, wil de „uitvlokking" tot stand komen. De Adsorbtie Proef van Castellani. (Afscheiden van „Hoofd" en „Bij" Agglutininen). Principe der Reactie. Het zuiver afscheiden van „Hoofd" en „Bij"- („groep"-„mede"-) Agglutininen uit een Serum, is alleen mogelijk door de proef van Castellani, waarbij de respec. Agglutininen door oververzadiging met de respec. Bacteriën, worden weggenomen (gebonden). De bacteriën worden vervolgens a/gecentrifugeerd en met het bovenstaande (heldere) serum wordt opnieuw de reactie verricht. Te onderscheiden zijn: a. De „Groep"- of „Bij"-Agglutininen, die deel uitmaken van de „HoofdAgglutininen. b. De „Meng" infectie, waar 2 „Hoofd-Agglutininen" naast elkaar in het serum voorkomen. De „Groep"- of „By" Agglutininen. Een Typhus-Immuunserum heeft in hoofdzaak Typhus-Agglutininen („hoofd" agglutininen), doch ook Agglutininen voor de „groep" (Para Tyhi „bij" agglutininen enz.) Wordt nu een Typhus-serum oververzadigd met Typhus-bacillen (homoloog), dan verdwijnen daaruit alle „Typhus"-Agglutininen, doch ook de „bij" agglutininen. Wordt ditzelfde Typhus-serum oververzadigd met de „groep" organismen (heteroloog) zoo verdwijnen daaruit alle „bij"-agglutininen, de „hoofd" agglutininen blijven echter bestaan. Voorbeeld: Serum X II 1 :50 — 1 :100 — 1 : 250 — 1 :500 — 1 :1000 1:2500 Typhus bac. II + + + '— + + H ++ — 4-+ — + — + P. Typh. B. bac. II i: + — 4-+ — -h+ — + De „oververzadiging": ^ Serum X Serum X wordt met Typhus-bac. oververzadigd = —Typhus r. ^ ™ ,, . Serum X „ P. Typh. B „ oververzadigd = p Typh. B Serum X II 1 : 50 — 1 : 100 — 1 :250 — 1 : 500 — 1 : 1000 — 1 :2500 Typhus j| Tvphus bac. — — — — — — — De „hoofd'' en „bij" Agglutininen zijn verdwenen. De infectie is dus Typhus geweest. SerUm X 1:50 — 1:100 —1:250 —1:500 —1:1000 — 1:2500 P. Typh. B. Typhus bac. + -f H + + H h+ — + — + — P. Typh. B. bac. — — — — De „hoofd" agglutininen (Typhus) blijven bestaan. De „titer" kan echter wat zijn gezakt (zie boven). De „mee" agglutininen (P.T.B.) zijn verdwenen. De infectie is dus Typhus geweest. De „Meng" infectie. Heeft een dubbele infectie plaats gehad, zoo zijn 2 verschillende „hoofd"agglutininen naast elkaar aanwezig, b.v. „hoofd-agglutininen" Typhus en „hoofdagglutininen" Para Typhus A. Wordt nu het serum oververzadigd met Typhus-bac. zoo verdwijnen daaruit de Typhus-agglutininen, de Para Typhus A-agglutininen blyven echter bestaan en omgekeerd. Voorbeeld: Serum Y || 1:50 — 1:100 — 1:250 — 1:500 — 1:1000 — 1:2500 Typhus bac. II + + H |- + H M ++ - P. Typh. A bac. |j ++ — ++ M + — + — De „oververzadiging": Serum Y wordt met Typhus-bac. oververzadigd = Typhus „ „ „ „ P. Typh.A. „ oververzadigd = pS jy'p'j, ^ ^.erU,m 1:50 — 1:100 — 1:250 — 1:500— 1:1000 — 1 :2500 Typhus Typhus bac. — — — — — — P. Typh. A. bac. ++ — ++ M + — + — De „hoofd" agglutininen P. Typh. A blijven bestaan, De „titer" kan echter wat gezakt zijn (zie boven). De „hoofd" agglutininen voor Typhus zijn verdwenen. De infectie is dus Typhus en P. Typh. A. geweest. SerUm Y II 1:50 — 1:100 — 1 : ?50 — 1 :500 — 1 :1000 — 1:2500 P. Typh, A. || Typhus bac. II H—I—I |- + H M M 4- — —- P. Typh. A. bac. — — — — — — — De „hoofd" agglutininen voor Typhus blijven bestaan, De „titer" kan echter wat gezakt zijn (zie boven). De „hoofd" agglutininen voor P. Typh. A. zijn verdwenen. De infectie is dus Typhus eri P. Typh. A. geweest. Van groot belang is de Proef van Castellani ook daar waar het geldt microorganismen van dezelfde soort, serologisch te rangschikken naar verschillende Typen, door het verwijderen der „bij" agglutininen (Meningokokken 1), Pneumokokken, Diphtherie, enz. enz.). Zie hiervoor de specialistische handboeken. Techniek der Methode: a. Serologische Gegradueerde Pipet (zie pag. 147) b. Agglutinatie-buisjes | Type A pag. 154 in smal zooveel in aantal als ( Kurk-rekje (zie pag. 156) er „verzadigingen" [ Buisjes A kunnen gemakkelijk moeten plaats vinden. ) worden gecentrifugeerd. Utensiliëtl: c. Centrifuge (minstens 3000 toeren per min.) d. Platina oogje. e. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in water). f. 2 a 3 Agar-culturen van de betreffende cultuur (24 uur oud). g. Serum. 10 mgr. droog serum -f «%0 ccm. ( .2 ^5 ^,0 CCm 1 Zoutsolutie 1°. Maak van Serum verd. Vzie P'Pet Pa£- I48' 1 s 10 of 2 deeltjes vloeibaar serum + 18 deeltjes Zoutsolutie (2X9 dl) zie nog onder 2°. Is het serum van huis uit in vloeibaren toestand aanwezig, zoo ga men gemakshalve als volgt te werk: 2°. Doe in Agglutinatie-buisje 2 deeltjes serum + 9 deeltjes Zoutsolutie. (niet 18 dl. zoutsol., anders wordt buisje te vol). 1) J. W. Janzen, Meningokokkendragers 1921. Proefschrift. 3°. Verwrljf hierin 2 volle Agar-culturen met platina oogje. (Cultuur tegen buiswand fijnwrijven en van lieverlede met de Zoutsolutie mengen). 4°. Voeg de overige 9 deeltjes Zoutsolutie toe (2x9 18), meng goed met oogje; de suspensie moet zeer dik zijn. (Schrijf op buisje precies den inhoud). 5° Plaats suspensie 8 a 12 uur bij 37° C. of 24 uur bij Kamer-temp. De beste maatstaf, dat alle agglutininen gebonden zijn, is dat de „bovenstaande" vloeistof (serum) na den „bindingstijd" nog getroebeld ziet. Deze bacteriën zijn niet gepraecipiteerd of uitgevlokt, omdat de Agglutininen reeds allen gebonden waren (oververzadiging). 6". Centrifugeer ± 20 minuten Zorg dat centrifuge zuiver gebalanceerd is, m.a.w. vul 2e Agglutinatie-buisje met water, weeg beide buisjes tegen elkaar op balans uit, en plaats beide even zware buisjes tegenover elkaar in centrifuge. 7°. Hevel bovenstaande volkomen heldere vloeistof (serum) met de serologische pipet van het bezinksel af (zie voor Techniek pag. 151) en breng dit over in schoon Agglutinatie-buisje. Is serum niet helder, zoo moet langer worden gecentrifugeerd. 8°. Verricht de Agglutinatie-reacties opnieuw tot dezelfde titergrens, met de betreffende Bacterie-suspensie(s), precies als op pag. 185 enz. Bedenk, dat al is het serum na het centrifugeeren volkomen Helder, er nog zeer goed bacteriën in kunnen zijn (infectieus!) Voorzichtigheid is dus geboden. Pipet desinfecteeren na afloop der reactie (zie pag. 172). Op de „reactiebuisjes" wordt Creoline gegoten (zie pag. 155); het stijve bezinksel wordt met platina naald naar boven gewerkt. De proef van Castellani wordt aangewend: 1°. Voor het afscheiden van „hoofd"- en „bij" Agglutininen. 2°. Voor het serologisch rangschikken van bacteriën van dezelfde groep, naar verschillende Typen. De Complement-bindings Reacties. Reactie van Bordet-Gengou. Principe der Reactie: (Bordet 1898). Wordt een proefdier (konijn) ingespoten met Schapen- (geiten) bloedlichaampjes, zoo ontstaan in het serum Antistoffen, Haemolysinen (Amboceptoren voor schapen-bloed), welke het vermogen bezitten de respec. bloedlichaampjes (Antigenen) „op te lossen", te „haemolyseeren" (uittreden der bloedkleurstof, iakkleurig en doorzichtig worden der bloed-suspensie). Haemolytisch Serum (Amboceptor) + Schapen (geiten) bloedlichaampjes (Antigeen) Haemolytisch Systeem Wordt nu het „Haemolytisch" serum verwarmd l/2 uur bij 56° C. (in-activeeren) of is het oud, zoo treedt, wanneer met de respec. bloedlichaampjes samengebracht, geen haemolyse meer op. Wordt nu bij dit geïnactiveerde serum, versch, normaal serum toegevoegd, zoo treedt wederom haemolyse op. Dit wijst erop dat in het Haemolytisch-Serum 2 stoffen voor de Haemolyse aansprakelijk zijn, welke ieder afzonderlijk geen haemolyse kunnen geven, n.m.: I. De Amboceptor. Haemolysinen Substances Sensibilisatrices II. Het Complement. Alexine. Welke in het proefdier ontstaat, als reactie op de inspuiting met de bloedlichaampjes. Is specifiek. Kan verwarming bij 56° C. verdragen (Thermostabiel.) Hecht zich aan de bloedlichaampjes (antigeen) en maakt deze voor de „oplossing" gereed (sensibiliseeren). In ieder serum aanwezig. Niet specifiek Kan geen verwarming bij 56° C. verdragen (Thermolabiel). Wordt door het „Amboceptor-Antigeencomplex" gebonden en geeft daaraan het vermogen Bloedlichaampjes te haemolyseeren, (maakt de haemolyse „compleet)." ocncma: A B C II /versch \ Complement | ^normaal Serum J Amboceptor (onverwarmd) Amboceptor (verwarmd) Amboceptor (verwarmd) + 4- -f- Schapen-bloedlichaampjes Schapen-bloedlichaampjes Schapen-bloedlichaampjes Totale haemalyse Geen Haemolyse Totale Haemolyse Zoo goed als er Amboceptoren voor Bloedcellen bestaan, zoo goed bestaan zij ook voor alle mogelijke andere Antigenen, wanneer proefdieren daarmede geïmmuniseerd worden (Bacteriën - cellen - eiwitten - extracten, enz.) B.v. Typhus-Amboceptoren I Cholera- „ na inspuiting met Typhus-bac. » » „ Cholera-vibrionen De Amboceptorcn onderscheiden zich nu van al de andere Antilichamen (Agglutininen - Praecipitinen - Antitoxinen, enz. welke naast de Amboc. in het zelfde serum kunnen voorkomen) doordat zij, wanneer met het respect. Antigeen samengebracht, daaraan het vermogen geven Complement te adsorbeeren („binden"). Deze „binding" behoeft niet gepaard te gaan met een zichtbare verandering van het Antigeen (cellen!) Dit is individueel en hangt ten nauwste samen met den physisch-chemischen toestand en de „broosheid" van het Antigeen. Bloedlichaampjes laten zich bij voorkeur Haemolyseeren Cholera-vibrionen „ „ „ sterk Bacteriolyseeren Typhus-baciilen „ „ „ „ zwak Btf al deze „reacties" verdwijnt echter Complement uit de vloeistof dit wordt dan ook als „maatstaf" voor de reactie aangenomen. Voorbeeld : Worden Typhus-Bac. + Typh. Irnm. Ser. (Typhus-Amboceptor verwarmd) bij elkaar gebracht en wordt er Complement (versch, norm. ser.) aan toegevoegd, zoo verdwijnt Complement uit de vloeistof, terwijl de Typhusbacillen worden opgelost (bacteriolyse). Dit is aan te toonen, door er later als Indicator een Haemolytischsysteem (B) aan toe te voegen. Het uitblijven der Haemolyse bewijst, dat het daartoe noodige Complement reeds verbruikt (gebonden) was! Noch Amboceptor, noch Antigeen hebben afzonderlek het vermogen Complement te binden (Bordet). De „binding" kan eerst plaats vinden, nadat de Amboceptor zich aan het Antigeen heeft gehecht. Met het ontstaan van het „Amboceptor-Antigeen"Complex, en de daarmede gepaard gaande physisch-chemische verandering is de „adsorbtie" van Complement mogeiyk geworden. (Een analogon vindt men'bij de „uitvlokking" der Agglutinatie-reactie, zie pag. 182 onderaan). Algemeene Regel lVanneer Antigeen + Antistof op elkaar inwerken, zoo verdwijnt in vele gevallen Complement uit de vloeistof (Bordet). De „binding" van Complement is dus een specifieke reactie, treedt alleen op wanneer Antigeen + Antistof „homoloog" zijn; zijn zij „heteroloog" zoo blijft Complement „vrij" (ongebonden). Voorbeeld: Typh. Bac. + Typh. Imm. ser. + later /Haemolyt. syst. 1 = gebonlfell door^°fT v J geen Haemolyse. Typh. Bac. + Cholera „ „ + later { „ „ ) = ?,eneg" dooHVcÏT. \ J Haemolyse. Het zwaartepunt der Complement-bindings-reactie, ligt nu in het zuiver uit titreeren van de hoeveelheid Complement; een te veel (overschot) hoe gering ook, evenmin een te weinig mag er ooit zijn. Er werken dus 2 Complexen op elkaar In: Complex A = Antigeen Antilichaam „Complex" (Bact. + Imm. ser.) Complex B = Amboceptor + Schapenbloedl. „Complex" j Indicator die beide op het Complement aanspraak kunnen maken. Wordt Complement wel door „complex" A gebonden „ n n*et »» » A „ Zoo blijft er geen Compl. over voor het later toegevoegde Haemolytisch systeem; dus geen haemolyse. Zoo blijft Compl. over; het later toegevoegde Haemol. syst. kan het aan zich binden; dus wel haemolyse. Om het „Complement" zuiver gedoseerd te kunnen toevoegen, moet dus alle niet doseerbare complement worden geweerd. In ieder versch serum, in vele lichaamsvochten is Compl. aanwezig, verschillend in sterkte en hoeveelheid. Zoowel in het Imm. ser. (complex A) als in den Amboceptor (complex B) is het dus aanwezig; het wordt daaruit verwijderd door beide sera 1/1 uur bij 560 C. te verwarmen, („inactiveeren" of complement „vrij" maken). Het Complement wordt nu toegevoegd in den vorm van verschnormaal serum, dat vooraf zuiver uitgetitreerd kan worden (bepalen der „minimale" hoeveelheid). Schema der Reactie: D Bact. Suspensie (Antigeen) + Imm. Serum (geïnactiveerd) < Complement I versch norm. serum „minim." hoeveelh. Amboceptor (geïnactiveerd) "4~ Schapen-Bloedlich. Haemolyt. Svsteem Geen Haemolyse Complement wordt door Antigeen + Imm. ser. gebonden, („homoloog") zoodat er voor het Haemolytisch systeem niets overblijft. E Bact. Suspensie (Antigeen) + NormaalSerum (geïnactiveerd) versch norm. serum Complement hoevedh ) Amboceptor (geïnactiveerd) + ^Schapen-BI oedlich. Haemolyt. Systeem Haemolyse Antigeen + Norm. serum binden zich niet („heteroloog") hebben dus ook geen complement noodig. Dit blijft „vrij" en wordt door het Haemol. syst. gebonden. De complement-bindings-reactie is dus niet anders dan een zuiver balanceeren van de 1 Antigeen | tegenover de „minimale" 3 Reagentia | A3J^tor+BloedUch J hoeveelheid Complement Eenige algemeene Wenken. Door de groote technische gecompliceerdheid, de „labiele" evenwichten bij deze reacties, betrachte men voor alles: De grootst mogelijke „Reinheid" De grootst mogelijke „Zorg" De grootst mogelijke „Nauwkeurigheid". De Reactie-buisjes en Rekjes. Gebruik dezelfde buisjes als voor de Agglutinatie-reactie; type A pag. 154 in de Kurk-rekjes (pag. 156). De rekjes zijn blijvend gemonteerd met 12 Buisjes. De Reiniging der Buisjes. Reiniging der buisjes van buitengewoon groot gewicht. Aangedroogd eiwit, zure of alkalische reactie kunnen positieve of negatieve reactie uitlokken. Zie voor Reiniging pag. 155. Pipetten. Gebruik de Serologische-gegradueerde Pipet van pag. 147. 1 pipet-deeltje ± l/20 ccm. Gemakkelijkheidshalve voege men er nog 1 deeltje aan toe, dus totaal 11 deeltjes. Patienten Sera en Liquores. Zeer weinig bloed noodig, zie voor Bloed-afname en Bloed-verzending pag. 159—162. Men zij voorzichtig met het gebruik van Alcohol enz. op de huid; dit kan „zelf-binding" der sera geven; goed droog wrijven dus. Sera (zoo versch mogelijk ontnomen) worden bij aankomst van bloedkoek afgepipeteerd, zie pag. 163 (zoo noodig eerst nog centrifugeeren), in Agglutinatie-buisje gedaan, (dichtkurken) dadelijk geïnactiveerd en in ijskast geplaatst (om bacterie-ontwikkeling tegen te gaan; dit geeft „zelf-binding" der sera; om deze rede mogen sera ook niet „oud" zijn). Is het serum in gedroogden toestand aanwezig, zoo behoeft niet geïnactiveerd te worden; door het „drogen" is het Complement er reeds uit. Liquores behoeven niet geïnactiveerd (bezitten geen Complement); op dezelfde wijze in ijskast bewaren. Purulent Lumbaalvocht eerst centrifugeeren. Het Inactiveeren (Complement „vrij" maken). y2 uur verwarmen bij 56° C. in Waterbad. Niet in 'broedstoof; hier duurt het zooveel langer eer de temp. binnen in buis is doorgedrongen. Het eenvoudigst is, een platte kurk-schijf te nemen, waarin gaatjes worden geboord, waardoor de dichtgekurkte buisjes kunnen worden geschoven, tot ± 0.5 cM. van de buismonding. Men laat de kurk op het water drijven, de buisjes met sera hangen zoodoende in het waterbad. Men zorge er voor dat het serum zelve enkele cM. (1-2) onder het vloeistoj oppervlak blijft (voor eventueele serumdrupp. welke langs buiswand achterbleven). De temperatuur wordt steeds door thermometer gecontroleerd. Hang den thermometer op gelijke hoogte als de buisjes. Bij „massa" materiaal, kan men de kurkschijf vervangen door metalen plaat, waarin gaatjes. Deze plaat wordt aan den rand van het waterbad gehangen, door platte, omgebogen haken. De buisjes hangen op dezelfde wijze in het waterbad. Buisjes kunnen boven op de kurkjes worden gemerkt. Te hooge verwarming kan „zelf-binding" der sera geven. n n n „ een „positief" ser. negatief maken, doordat de specifieke amboceptoren vernield worden. De Physiologische Zoutsolutie. De Zoutsolutie luistert zeer nauw. Men neme zuiver keukenzout (magnesium-vrij). 0.85 o/o NaCl in Aqua Dest. De Amboceptor voor Schapen-(geiten) Bloedlichaampjes. Opvangen en Defibrineeren van het Schapen(geiten)-bloed. Utensiliën : Cl. Steriele Record-spuit met „dikke" Canule (10 min. uitkoken in water) b. Scherp Scheermes. C. Water en Zeep. d. Steriel Kolfje met glas-parels. €. Steriele Physiol. Zoutsolutie in Kolfje (0.85 % NaCl in water). ƒ. Steriele Centrifugeerbuizen. g. Centrifuge + 3000 toeren per min. Bereiding: 1°. Bindt de „voor"pooten van dier aan elkaar. Bindt de „achter" „ ,> „ „ elkaar. 2". Leg het dier op een tafel, met den kop over tafelrand heen hangend. 3o. Scheer de hals-haren af en stuw de hals-vene (druk). 4o. Schuif in Vena Jugularis de Canule (door middel van Record-spuit, stevig duwen); zoodra het bloed stroomt, neem spuit van „canule" af en vang het uitvloeiende bloed uit canule in Kolfje op (alles steriel.) Dadelgk flink schudden met de glasparels (zonder ophouden anders stolt het bloed) ± 5 min. (defibrineeren). Schapen-bloedlichaampjes verdienen de voorkeur; zij geven een hoogeren titer en minder Agglutininen. Het wasschen der Bloedlichaampjes om het Serum te verwijderen. 1°. Verdeel het gedefibrineerde bloed in 2 centrifugeer-buizen (steriel). Weeg beide buizen tegen elkaar uit op balans, teneinde centrifuge precies gelijk te belasten. Het overblijvende bloed in ijskast bewaren. 2°. Centrifugeer ± 10 min. Opdat wattenprop niet naar binnen zuigt, trekke men deze half uit buis, en trekke hem rondom O over den bovenrand heen. Desnoods doet men er dan een elastiekje I omheen. Desnoods hier zonder wattenprop centrifugeeren, de steriliteit weegt hier niet zoo ernstig. 3°. Geef op buizen streepje, daar waar vloeistof eindigt (met glaspotlood) Doet men dit niet, zoo wordt de suspensie ongelyk van dikte. 4°. Pipeteer bovenstaande vloeistof af (serum). Heel eenvoudig is aan waterstraal-pompje steriele Pasteur'sche Pipet te verbinden, en zoo de vloeistof telkens af te zuigen. 5°. Vul bij met Zoutsolutie, meng goed, door buisje tegen duim om te keeren. 6°. Centrifugeer opnieuw + 10 min. 7°. Pipeteer vloeistof opnieuw af (zie bij 4°), vul weer bij met Zoutsolutie, meng goed en centrifugeer. Doe dit 3—5 maat. Ten slotte moet bovenstaande vloeistof volkomen helder zien. 8°. De afgecentrifugeerde bloedlichaampjes worden eindelijk bijgevuld met Zoutsolutie tot het oorspronkelijk volume (dus tot streepje). De bloed-suspensie mag geen spoor „haemolyse" vertoonen. Inspuiten der Konijnen met de „gewasschen" Bloedlichaampjes". Utensiliën: a. Injectïespuitje (5 a 10 ccm.) met 3 a 4 „dunne" canules (steriel; 10 min. uitkoken in water). b. Schaar. C. Watten. d. Alcohol 96 %. Gebruik voor ieder konijn andere Canule. Daar het eene konijn veel beter haemolysinen geeft dan het andere, neemt men meerdere konijnen. Persoonlijke ervaring: Men krijgt hooger en stabieler titer bij langzame Immunisatie met kleine quantiteiten, dan bij snelle (dagelijksche) Immunisatie met groote quantiteiten. De Inspuiting. Bij 2 a 3 konijnen worden de Bloedlich. als volgt ingespoten: 1°. Bereidt de oor-vene (buitenste randvene) voor als op pag. 164. 2°. Zuig bloed-suspensie in spuitje op. 30. Breng Canule in oor-vene precies als op pag. 164 bij 60 en spuit in : lste Dag Vio ccm. Intraveneus 6e Dag V4 ccm. „ 12e Dag '/5 ccm. „ 18e Dag 1 ccm. Intraperitoneaal 24ste Dag 2 ccm. „ Om den Anaphylactischen-Shock te ontgaan, worden na de 2e week de intra-veneuse injecties door intra-peritoneale vervangen Ook kan men „intraveneus" blgven inspuiten, mits men dan na de 2e week, eerst een zeer kleine fractie van de quantiteit inspuit en % uur later de rest. Anders loopt men kans dat de dieren plotseling dood blijven. 4 a 5 dagen na laatste inspuiting, wordt de „Titer" van den Amboceptor bepaald, die minstens 1 :2000 moet bedragen (zie onder). Is dit niet het geval, zoo kan men doorgaan met Intra-peritoneale injecties; men loopt dan wel gevaar dat er vele Agglutininen ontstaan (Agglutinatie der Bloedlich.) Meestal moet men zijn toevlucht tot andere konijnen nemen. Een voorloopige Titer-bepaling, bv. na de 3de injectie kan reeds uitwijzen of de reactie „aanslaat". De Titer-bepaling van den Amboceptor. Om de „sterkte" van den Amboceptor te bepalen, n.m. de kleinste hoeveelheid welke nog volkomen oplossing der Bloedlichaampjes geeft, in tegenwoordigheid van versch Complement, wordt onderstaande proevenreeks ondernomen: 1 deel 10 0/o I Complement c'a'en<*e hoeveelheid 1 deel Amboceptor (geïnactiveerd)) „aemolytisch 1 deel 5 0/0 Bloedlich. Suspensie } systeem \ Welke de plaats innemen van 2 deelen Physiologische Zoutsolutie Bact. + Imm. ser. der „Hoofd"- proef, die uit totaal 5 deeltjes J bestaat. De „titer" moet minstens 1:2000 bedragen, m.a.w. '/2ooo Amboceptor moet nog volkomen oplossing der Bloedlich. geven. Het Complement. Als Complement wordt gebruikt 10 o/0 versch, normaal Cavia Serum. Het bloed wordt by de Cavia ontnomen door Cor-punctie: 1°. Injectie-spuitje van + 5 è 10 ccm. wordt uitgekookt (10 min. in water). 2». Houdt Cavia in de lengte gestrekt en vertikaal (in linkerhand Kop om den hals, achterpootjes gestrekt in rechterhand, bediende!) 3». Palpeer het hart en zoek den hart-stoot op daar, waar de punt-stoot het best te voelen is. 4». Steek de injectie-spuit in de 3e Intercostaal-ruimte, vlak naast het Sternum. Dit vereischt veel oefening. 5». Het bloed wordt voorzichtig in de spuit geaspireerd (+ 5 ccm.) en vervolgens in centrifugeer-buis uitgespoten. 6». Plaats het bloed ter Serum-afzetting eerst 10 min. bij 370 C. en dan in Ijskast. (Men krijgt zoodoende veel meer serum). Centrifugeer daarna. Spuit bij Cavia Subcutan gelijke hoeveelheid steriele Physiol. Zoutsolutie (compensatie vochtverlies). 7o. Pipeteer het Complement van het Bloed-coagulum af (behoeft niet steriel); doe dit in reageerbuis en bewaar het bevroren (in cylinder met fijngestooten ijs in ijskast). Heeft men moeite met de Cor-punctie, zoo kan men het dier eenvoudig den nek afsneden. Liefst „alleen" de Carotiden, anders is er kans op maag-inhoud. De 10 u/0 verdunning (verd. 1:10). Gebruik de Serologische pipet (pag. 147). (1) 3 deeltjes Complement + (9) 27 deeltjes Zoutsolutie ^ Complement Het Complement Iaat zich niet lang bewaren. Steeds versch (den dag zelf) ontnemen. De 10% verd. even voor het eigenlijke gebruik samenstellen. De Amboceptor (Haemolytisch Serum). Het bloed van het Amboceptor-Konijn(en) wordt ontnomen uit rand-vene van het oor ± 1 ccm., en het Serum verkregen precies op dezelfde wijze als op pag. 164. Het Inactiveeren (complement „vrü" maken). Verwarm het Serum l/2 uur bij 560 C. in Waterbad. Zie voor Techniek pag. 192. De 5 °/0 Bloed-lichaampjes Suspensie. Het Schapen-(geiten) Bloed wordt den dag zelfvan de Proef ontnomen en gedefibrineerd (zie daarvoor pag. 193). Waar de reactie in enkele uren verloopt, behoeft het bloed niet steriel te worden behandeld. De Bloedlichaampjes worden 3 X gewasschen (zie pag. 193). De oplossing, zooals die op pag. 194 tot en met 8° is verkregen, wordt als volgt met de serologische-pipet verdund: 1 deeltje Bloedlich. +19 deeltjes Zoutsolutie | go/o Bioed. 2 " » + 3* » " ( Suspensie o Jf „ •" » n ) enz. enz. al naar de hoeveelheid „deeltjes" die men noodig heeft. De Bloedlichaampjes-Suspensie mag geen spoor „haemolyse" vertoonen. Techniek der Titer-bepaling Amboceptor. a. Serologische Gegradueerde Pipet (zie pag. 191). b. ± 12 Agglutinatie-buisjes (Type A pag. 154) in Kurk-rekje Buisjes moeten gemakkelijk uit de gaatjes te lichten zijn, hetzelfde Utensiliën: als op pag. 156 onderaan. voor de Serum-verd. Rekje I C. ± 12 Agglutinatie-buisjes (idem) \ in Kurk-rekje gewoon ƒ voor de Reactie zelve Rekje II d. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in Water.) e. „Dikke" platina Naald. Reagentia: /0°/o Complement (zie pag. 195) Haemol. ƒ 5% Bloedlich. Suspensie (zie pag. 196) Systeem \ ƒ deeltje Amboceptor (geinact.) (zie pag. 196) Schema der Werkwy'ze: 1°. Ontneem Schapen-(geiten)bloed, 3 X wasschen. Maak er de 5 % oplossing van (zie pag. 196). 2». Bereidt den Amboceptor en Inactiveer (zie pag. 196). 3». Ontneem Complement en plaats dit In Ijs (zie pag. 195). Verdun dit even voor het moet worden gebruikt. Vervaardig de Amboceptor verdunningen op de volgende wijze: Verklaring der Teekens: 1 C = 1 deeltje 10 % Complement 1 0 = 1 deeltje 5 % Bloed-suspensie 1°. Plaats onder de resp. buisjes op de kurkrekjes, de serum-verdunningen Rekje I en II. 2°. Maak de verd. van den Amboceptor (rekje I) precies zooals in schema staat aangegeven. Ga niet hooger dan 1:5000 (zie voor techniek pipet pag. 149). Het verdient aanbeveling, zooveel mogelijk eerst het serum in al de buisjes te doen; vervolgens achter elkaar de NaCl toe te voegen. Dit werkt zooveel vlugger. 3°. Doe nu in ieder buisje der „Reactie zelve" 1 deeltje der respec. Serum-verd. Pipet telkens tusschen in doorspoelen (behoeft niet onder kraan, in reageerbuis voldoende.) 4°. Voeg vervolgens de 2 deeltjes Zoutsolutie toe. 5°. „ „ / deeltje 5% Bloed-suspensie toe. 2 Z = 2 deeltjes Physiologische Zoutsolutie. 1 S 1: 50 = 1 deeltje Serum (Amboceptor) verd. 1:50 6°. Maak van het Complement de verd. 1 :10 (zie pag. 196). 7°. Voeg vervolgens 1 deeltje 10°l0 Complement toe. 8°. Vergeet de Controles niet: Controle I = Bloed-suspensie + Zoutsolutie Controle II = „ „ -f- Amboceptor Is 10 Controle III = „ »» + Complement Om te zien of de Bloedlich. zonder Complement intact blijven. Om te zien of Ambocep. geheel Compl. „vrij" is. Of Bloedlich. met Compl. intact blijven. 9°. Meng de Reactie met „platina naald, van achteren af beginnen naar voren toe (zie nog pag. 173). Denk hier echter aan de „controles" (tusschen Controles uitgloeien). Werk de „luchtbellen" naar boven. 10°. Plaats de proef bij 37Q C. voor 2 uur. De suspensie in de buisjes ziet „licht-rood?' van kleur, homogeen en ondoorzichtig (dekkleurig). Het Aflezen der Proef. De Amboceptor „Titer". De Titer van den Amboceptor moet minstens 1:2000 bedragen. Er mag geen „agglutinatie" der bloedlich. optreden (donkere laag). De „Haemolyse" vertoont zich als een lakkleurig, helder rood en volkomen doorzichtig worden der Bloed-suspensie. Nauwkeurig toezien waar de zuivere grens is gelegen tusschen volkomen oplossing der Bloedlich. en een nog niet geheel opgelost zijn. Als eind-titer (grens) neme men het laatste buisje waar nog volkomen oplossing der Bloedlich. heeft plaats gehad. Niet dubieeren, doch de grens zuiver en ruim trekken. Bij bovenstaand schema is de titer-waarde van den Amboceptor (grens-waarde) 1:3000. „Agglutinatie" der bloedlichaampjes is niet toegestaan (donkere laag op bodem). Men neme dan anderen Amboceptor. De proef heeft alleen waarde, wanneer de „controles" volkomen intact zijn: Controle I = Bloed-Susp, -f- Zoutsolutie mag geen - Haemolyse geven z.oo ja, aan aeugi oi ae Zoutsol. niet (te laag %) of de buis is „vuil" of de Bloedlich. zijn „oud" Controle 11= „ „ + Amboceptor 1 s 101 mag geen Haemolyse geven Zoo ja, dan is het serum niet voldoende geïnactiveerd Controle III = „ ,* + Complement mag geen Haemolyse geven Zoo ja, dan is er een fout in het Compl. Hoe hooger de titer, hoe beter. De „titer" moet minstens 1:2000 bedragen. Laat men de proef 24 uur staan, zoo zakken de bloedlich. uit; waar geen Haemolyse is, vertoont zich op bodem een laagje bloedlich. met heldere bovenstaande vloeistof. Het Conserveeren van den Amboceptor. Bevat de Amboceptor voldoende Haemolysinen, zoo is het gewenscht het Serum vast te leggen. Het conserveeren kan op ^— ,n „vloeibaren" toestand. tweeërlei wijze geschieden ^ in „gedroogden" toestand. Verbloeden Konijn : A. Het Konijn moet „steriel" verbloed worden, op volgende wijze: Het verbloeden: 1». Scheer de hals-haren af en reinig de huid met Alcohol (goed droog wrijven). 2". Geef konijn slag in den nek, snijdt plotseling beide Carotiden door (hals afsnijden.) 3". Houdt konijn boven trechter en laat het uitbloeden (niet geheel, anders komen lichaamsvochten mede). 4». Schenk bloed dadelijk over in wijde centrifugeerbuizen, laat stollen in Ijskast. 5». Centrifugeer en pipeteer serum af (zie onder). B. Verbloedt het konijn door „onderbinding" der Arteria Carotis (steriel). Laat bloed stollen, centrifugeer en pipeteer het Serum af (zie onder). Zie voor Operatie-Techniek de special, handboeken. Het „droog" Conserveeren van het Serum. 1°. Pipeteer Serum van bloedkoek af (steriel) en verdeel dit over de oppervlakte van verscheidene „groote" steriele Petri-schalen (zeer dunne laag). 20. Plaats schalen waterpas en open in Exsiccatoren (2 a 3 schalen boven elkaar), boven chloorkalk. 3o. Sluit exsiccator hermetisch, door tusschen de randen vaseline aan te brengen (dunne laag). 4". Pomp de lucht uit (± 10 k 20 min.) en plaats exsicc. bij 370 C. voor 1 a 2 dagen. Barstjes op het plaatoppervlak geven te kennen dat het serum-laagje „gedroogd" is. 5°. Krab het gedroogde serum van de schaal-bodems af (met rand van objectglas), en strooi de cristalletjes op schoon, wit papier. 60. Breng de serum-cristalletjes over in eigen gemaakte Ampullen (gewone glasbuis uittrekken in vlam) en smelt deze dicht (in ijskast bewaren). Utensiliën: Steriele trechter (groot model) „ maatglas 200 ccm. Scherp scheermes Water en Zeep Alcohol 70 of 90 % Het serum kan ook gedroogd worden met Electr. apparaten (in den handel). Door het „drogen" is de Amboceptor Complement „vr^j" geworden. Bepaal opnieuw de „titer-grens", daar Amboceptor door het „drogen" altijd wat achteruit gaat (hoe hooger de oorspronkelyke titer-grens dus, hoe beter). Het serum heeft door het drogen 10X zooveel vocht verloren, (zie pag. 165), voor de proef neme men dus: 10 mgr. „droog" Serum + 10/jo ccm- (^ï^pipèt) Zot,tsolutie j Is de „titer-grens" vastgesteld, zoo plaatst men deze op de Ampul. Het „vloeibaar" Conserveeren van het Serum. lo. Pipeteer serum van bloedkoek af (steriel) en breng dit over in smalle, kleine reageerbuisjes (steriel). 2o, Inactiveer M uur by 560 C. in Waterbad. (Zie voor Techniek pag. 192) 3o. Breng het serum over in kleine, steriele Ampullen (in den handel) % a 1 ccM. Men doet het beste telkens met een steriele Pasteur'sche pipet het serum in iedere Ampul over te brengen; voor iedere Ampul nieuwe pipet. Smelt de Ampullen dicht, en bewaar deze bevroren (inFrigo apparaat beneden0°C.) Persoonlijke ervarings Hoewel de „titer" daalt bij het „drogen" van den Amboceptor, blijft de eenmaal verkregen titer lang „op peil", terwijl het „vloeibare" serum gestadig in titer achteruit loopt. Titer-waarde van Amboceptor moet na verloop van tijd weer gecontroleerd worden. De „Voor"proef. (Complement-titratie) Iedere Immuniteits-reactie kan, wat hare „specificiteit" aangaat, op tweeërlei wijze worden toegepast: a. of het Antigeetl is bekend, het Serum moet dan worden bepaald. b. öf het Serum is bekend, het Antigeen „ „ „ Bij onderstaande proef is het Serum bekend het Antigeen onbekend Op pag. 189 is reeds ten duidelijkste gebleken, dat een „te veel" of een „te weinig" aan Complement, nooit mag bestaan. Waar het zich nu kan vooidoen, dat de reagentia ieder voor zich reeds complement „aan zich kunnen binden" (adsorbeeren), is het noodzakelijk deze event. „eigen binding" van de 3 Reagentia j Antigeen j Imm. Ser. Amboceptor + Bloedlich. ) tegenover de „minimale" hoeveelheid Complement zuiver „uit te titreeren" Schema der Complement-titratie. A. , ■ . in dalende 1 deel | Compl. | hoevee,heid Ambocept.' geïnactiv. Haemolyt. 2 dlenj 4. Syst. 5% Bloed- MSB lich. B. 1 deel Bac.Susp. (Antigeen) , . . in dalende 1 deel I Compl. I , hoeveelheid Ambocept. geïnactiv. Haemolyt. 2 dien 4. Syst. 5% Bloed- MSB lich. . C. 1 deel Imrtl. Ser. (geïnactiv.) , . . in dalende 1 deel Compl. I hoeveelheid Ambocept. geïnactiv. Haemolyt. 2 dien 4. Syst. 5 % Bloed- MSB lich. Ter „Controle" wordt steeds een Normaal-Serum aan deze proef toegevoegd. Het Complement krijgt eerst gelegenheid zich apart aan het Reagens te „binden" (B-C) 1 uur bij 370 C., waarna het Haemolytisch-systeem wordt toegevoegd. Voor de „eigenlijke" uitvoering der „ Voorproef zie men dadelijk pag. 206. De „maximaal" Gesensibiliseerde Bloedlich. MSB Haemolytisch Systeem. Het is de groote verdienste van Sormani geweest, de „gevoeligheid" van het „Haemolytisch-systeem" als Indicator zoo hoog mogelgk op te voeren, zoodat het geringste verlies aan Complement zich dadelijk doet gevoelen, door een niet optreden der Haemolyse. De resp. Bloedlichaampjes worden daartoe met een overmaat van Amboceptor (Haemol. serum) samengebracht en op deze wijze maximaal „gevoelig gemaakt" (gesensibiliseerd) = MSB. Voor „Voor"- en „Hoofd!'proef wordt dan ook een 8 a 10 voudige Amboceptor-titer gebruikt. Voorbeeld: De Amboceptor-titer = 1:3000 (zie pag. 200) De 10 voudige „ „ = 1 :300 Haemolytisch j Systeem 8 a 10 voudige Amboceptor-titer | + 5 °/0 Schapen (geiten) Bloedlich-suspensie I aa Bereiding van het Haemolytisch Systeem MSB Bereken eerst (ruim) hoeveel deeltjes Haemol. syst. voor „Voor-" en „Hoofd"proef noodig zijn (zie schemata pag. 207 enz.). Voor een „enkelvoudige" Complement bindings-reactie bestaande uit: 1 Antigeen tegenover 1 Serum X en 1 Norm. Serum totaal ± 140 deeltjes MSB dus 70 deeltjes 10 voudige Amboceptor 70 deeltjes 5 % Bloedlich. Suspensie De Amboceptor: 1°. Bereken de 10-voudige Amboceptor-titer: De „titer" van den Amboceptor is hier = 1:3000 (zie pag. 200) De 10 voudige „ „ „ „ „ =1:300 2°. Ga uit van Amboc. verd. 1 ilO Gebruik Serologische pipet. 10 mgr. „droog" serum + 10/10 (2.^ . ?CnJ'.. 0j \zie pipet/ Zoutsolutie 1 deeltje „vloeibaar" ser. + 9 deeltjes Zoutsolutie. 3°. Voor „eind-verd." 1 :300 moet Amboceptor dus nog 30 x worden verdund: = 1 deeltje Amboceptor verd. 1:10 + 29 deeltjes Zoutsolutie 3 „ „ „1:10+87 Voor een groot aantal reacties, dus veel vloeistof, verandert men de „deeltjes" in ccm., de berekening blijft dezelfde. De 5% Schapen-(geiten) Bloedlichaampjes. 1°. Bereidt de Bloedlichaampjes-Suspensie voor, precies als op pag. 193 tot en met 8°. 2°. Maak daarvan de 5 % oplossing: 1 pipet-deeltje Bloedlich. 4- 19 deeltjes Zoutsolutie 4 „ »» h "76 pt Het Haemolytisch-Systeem MSB 1°. Voeg bij elkaar I Gelijke deelen (^"deeltjes) 10-voudige Amboceptor I Gelijke „ (70'deeltjes) 5 °/o Bloedlich.-suspensie IHaemolytisch Systeem Goed mengen. Plaats 2 uur by 37» C. (samen laten „binden"). 2°. Verdeel daarna Haemol. Systeem in Centrifugeer-buizen en wasch de Bloedlich. 3 X precies als op pag. 193 tot en met 8°. Meng goed. Men is nu in het bezit van een oplossing maximaal gesensibiliseerde bloedlichaampjes MSB, waar, door het „wasschen" geen konijnen-serum meer aankleeft, dat later „zelf-binding" zou kunnen geven. Indien Agglutinatie der Bloedlich. optreedt (donkere laag bloedcellen op bodem) door dezen overmatig sterken Amboceptor (dus ook kans op veel Aggiutininen), zoo kan men probeeren met 8-voudigen Amboceptor, zoo niet, dan anderen Amboceptor nemen. Agglutinatie is niet toegestaan. De Complement-verdunningen. a. ± 10 Agglutinatie buisjes (Type A pag. 154) Utensiliëtl: b. Serologische Pipet (zie pag. 147) C. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in water) 1°. Het onverdunde, versch ontnomen Complement (zie voor afname enz. pag. 195) wordt eerst 10 X verdund = ^ verd» (1)3 deeltjes Complement + (9) 27 deeltjes Zoutsolutie \ ^ ^ Van verd. 1:10 worden nu volgende verdunningen gemaakt (met serologische-pipet): Hoeveelheid voor 9 reacties: 6 : 100 5 : 100 4 : 100 3 : 100 2 : 100 1 : 100 6 deeltjes Compl. + 4 deeltjes Zoutsolutie 5 ,, ,, I 5 ji O 4 » „ + 6 „ „ 3 „ „4-7 „ „ 2 „ „ + 8 „ „ 1 ^ » ï» In alle buisjes eerst Complement. Vervolgens achter elkaar de Zoutsolutie toevoegen Plaats de compl. verd. onder de buisjes op het Rekje. Voor „grootere" quantiteiten Complement (groot aantal Reacties): Onverdund Complement 6 gewone Reageerbuizen Pipet van 1 ccm. in 10 deelen verdeeld „ 10 ccm. in ÏOO „ ccm. ccm. ccm. ccm. ccm. ccm. Complement 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Zoutsolutie 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 Antigeen (Bacillen-Suspensie). Gebruikt worden 24 uur oude Culturen (Agar), waarvan de suspensie in Zoutsolutie wordt gemaakt, precies als voor de Agglutinatie-reactie (zie pag. 166) vooral niet te dik. Sera, Sera worden vooraf geïnactiveerd (zie pag. 192). Zijn zij in „gedroogden" toestand aanwezig, zoo is het Complement er reeds uit. De verd. 1:10 wordt ten opzichte van het Complement uitgetitreerd. li ii 1 5 100 ,, ii ii ii ii ii li Dit geschiedt, omdat het voor kan komen, dat verd. 1 :10 Complement bindt, terwijl verd. 1 :100 dit niet meer doet. De verdunningen: 1 pipet-deeltje Serum + 9 pipet-deeltjes Zoutsolutie I verd. [ 1 :10 1 » » » 1:10 -¥9 „ „ „ % I verd. f 1:100 Is het Serum „droog" zoo neemt men: (pag. 165) 10 mgr. + 10/,o (2 ^ /l0} ccm. Zoutsolutie = verd. 1:10 enz. \zie pipet/ In de proef wordt steeds een „normaal" serum betrokken, ter „controle", alleen in de verdunning 1 :10. Techniek der Complement-Titratie: a. Serologische, gegradueerde Pipet (zie pag. 191). b. 5 Kurkrekjes met ieder ± 12 Agglutinatie-buisjes Typ. A pag. 154 1 voor de ƒ 5 Reacties 1 »» »» »» i 12 ,, „ 1 Utensiliën: ' voor de • Compl. verd. »» »» »» ± ^2 „ n voor ae > Ser. verd. /1:10- 1:100 C. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in water) d. „Dikke" platina naald. Reagentia: Bacillen-Suspensie in Zoutsolutie (zie pag. 205) Complement-verd. 1:100 tot 6 :100 (zie pag. 205) Haemolytisch Systeem, MSB (zie pag. 203) Immuun-Serum ïsio-i-.ioo (zie pag. 205) Normaal-Serum 1:10 Schema der Werkwijze: 10. Dag te voren: „Buisjes" en „Rekjes" klaarmaken en resp. verdunningen duidelijk op rekjes plaatsen. Waterbad 56° C. in orde maken. 2o. Des ochtends vroeg: Schapenbloed afnemen en „wasschen" (zie pag. 193». 3o. Amboceptor bereiden (10-titer eenheden) zie pag. 204. 40. Haemolytisch-Systeem by elkaar voegen en 2 uur by 37o C. (zie pag. 204). 50. Sera Inactiveeren M uur bij 56° C. zie pag. 192. (Indien dit niet reeds is geschied). 6°. Complement afnemen en centrifugeeren (zie pag. 195). 70. Suspensie Bacillen maken (zie pag. 166). 80. Imm.-Ser. verdunnen 1:10-1:100 ) kt o , 1 zie Paê- 206- Norm.-Ser. „ 1 :10 ) v & 9°. Complement verd. maken (zie pag. 205). 10°. 1ste gedeelte „Voor"proef, 1 uur bij 37° C. zie pag. 208. lio. Haemolytisch Syst. „wasschen" en MSB maken zie pag. 204. 120. 2de gedeelte „Voor"proef bij 37° C. zie pag. 208. 130. „Hoofd"proef (zie verder) A. De Amboceptor mag „niet meer" dan C 2—C 3 noodig Hebben (zie Reeks 1). B. Meer dan 2C „eigen binding" zyn niet toegestaan (Reeks II, III, IV, V). C. Er mag „geen" Agglutinatie der Bloedlichaampjes optreden. Verklaring der Teekens Bac. = 1 deeltje Bacillen-Suspensie Z = 1 „ Physiol. Zoutsolutie C1-C2 = 1 „ Complement verd. 1:100-2:100 enz. S 10 =1 „ Imm. Ser. verd. 1:10. S 100 =1 „ „ „ „ 1:100 NS 10 = 1 „ Norm.,, „ 1:10 MSB | = 2 „ Haemolytisch Systeem MSB = geen Compl. Binding, dus Haemolyse. + = wel „ „ geen Haemolyse. Plaats de 5 Rekjes precies achter elkaar. Gebruik Serologische Pipet. 1°. Breng eerst in de buisjes van Reeks II = de Bacillen-Suspensie. „ vervolgens „ „ „ „ „ III = de Imm. Ser. verd. 1:10 „ „ „ „ IV = „ „ „ „ 1:100 „ „ ,, „ „ V = „Norm.Ser. verd. 1:10 om de reactie op 5 2°. Voeg nu in alle buisjes = de deeltjes Zoutsolutie j brengen 3°. Voeg vervolgens de Complement verd. C 6—C1 toe. Eerst alle buisjes met C I, dan van C2, enz. enz. 4°. Vergeet de „Controles" niet (zie schema) doch zonder MSB. Controle I _ 2outsolutie -f- {Haemolytisch Syst., Reeks I I J om te zien of de Bloed-susp. zonder Compl.„intact" blijft Controle I ®ac" I ) Reeks II- +J "'-|V'V Is,» I I om te zien of de „reagentia" ieder voor zich de Bloedsusp. „intact" laten. Controle II _ Zoutsolutie Reeks II om te zien of „Auto" agglutinatie optreedt enz. enz. 5°. Meng met platina-naald, van achteren af beginnen, naar voren toe (zie pag. 173). Telkens uitgloeien tusschen iedere nieuwe Reeks. Verwijder de „luchtbellen" met platina-naald. 6°. Plaats de geheele Proef 1 uur bij 370 C. opdat „binding" van Complement kan plaats vinden. 7°. Voeg daarna 2 deeltjes MSB toe. Meng goed met platina-naald. 8°. Plaats de proef + 3/4 d 1 uur bij 370 C. Zoolang totdat de Haemolyse niet meer voortschrijdt, dit is meestal na 3/4 k I uur het geval. Het Aflezen der „Voor"-proef. Zie voor beoordeeling der „Haemolyse", schemata op pag. 200. De grens wordt hier op dezelfde wijze getrokken; alleen het buisje waar volkomen „haemolyse" is opgetreden, mag als grens-waarde worden aangenomen. Meer dan 2 dosis Compl. „eigen-binding" zijn niet toegestaan. Reeks I = De „minimale" hoeveelheid Compl. voor het Haemolytisch- systeem ligt hier by c 3 Reeks II = By het Antigeen ligt de grens by c 4 Er is dus 1 C gebonden. Vertoont Antigeen „sterke" eigen-binding, zoo kan het worden verdund. Reeks III = By het Imm. Ser. 1:10 ligt de grens by C 4 Er is dus 1 Compl. gebonden. Reeks IV = Bij het Imm. Ser. 1:100 ligt de grens by C 3 Er is dus geen extra Compl. gebonden. Reeks V = By het Norm. Ser. 1:10 ligt de grens by 3 Er is dus geen extra Compl. gebonden. Controle I _ I | mag geen II ^00 ia> dan deugt of de Reeks I - Zoutsolutie + Haemolytisch Syst.} Haemolyse NaCl niet (te laag %)of geven de b"'f }s of de "• ' II Bloedlich. zijn „oud". Controle II Bac- ( ) Reeks II- = S 10 j mag geen Zoo ja, dan zijn een III-IV-V S100 ' ) " *♦ ( Haemolyse der reagentia NS 10 ( I êeven Haemolytisch Controle II ■■ Reeks II — ^ac' Zoutsolutie II De . Suspensie moet || fraai „homogeen" zien, Zijn de „Controles" niet intact, zoo is de proef waardeloos. Benoodigde hoeveelheid Complement voor „Hoofd"proef: t ,nbindt dUS 1 CXtra d0SiS C AntiSee" bindt dus 1 Extra dosis C imm. Ser. 1:10 „ „ 1 extra „ C Imm. Ser. 1:100 „ „geen „Mimmale" hoeveelheid Norm. Ser. 1:10 „ geen " " voor Haemolyt. Syst. C3 „Minimale" hoeveelheid voor Haemolyt. Syst. C3 Totaal C5 Totaal ca Voor de Imm. Ser. verd. 1 :10 Voor de Imm. Ser. verd. 1:50 » » »» n „ 1 :100 en hooger " » Norm. „ „ 1:10 en hooger rv c •_ Deze proef Is met opzet zeer ongunstig gesteld: wanneer gezorgd wordt dat zelden3 0VpC Zl1" " "bederf" bacterie-°r'twikkeling) zoo treedt „eigen-binding" Als 1:100 „binding" vertoont, zoo probeert men ander serum te krijgen. De „HoofcP'proef. („Eigenlijke" Reactie) Schema: Serum-Proet. 1 deel Bac. Suspensie (Antigeen) ( geïnactiveerd ^ 1 deel Imm. Ser. < in dalende > V hoeveelheid J „minim." hoeveelh. 1 deel Complement in ,.voor"proef ^bepaald (C 5-4) 2 dln |HaemM°'ytKSySt-) Indicator iVlO D Controle-Proet. 1 deel Bac. Suspensie (Antigeen) {geïnactiveerd ï in dalende > hoeveelheid J „minim." hoeveelh. Complement in „voor"proef ——bepaald (G 4) /Haemolyt. Syst.) 2dl"\ MSB ) I"d'=ato>- Techniek der „Hoofd"pi*oef: a. Serologische-gegradueerde Pipet, zie pag. 191 b. 1 Kurkrekje met ± 12 Agglutinatie-buisjes I dger Typ. A pag. 154 ) verd. Rekje I | voor de 1 „ „ 12 „ „ Norm. ser. j verd. Rekje II Utensiliën: ) voor «Hoofd" 1 „ „ 15 „ „ proef J Imm. ser. I voor „Hoofd" 1 n ». 15 „ „ \ proef ) Norm. ser. C. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCI in water). d. „Dikke" platina naald. Reagentia: Bacillen Suspensie in Zoutsolutie (^"^,,S!ereed ult "Voor "j ,,Imm." ser. verd. 1:10. „Norm." „ verd. 1:10. _ , , (onverdund, uit het Ijs; reeds Complement gereed uit „voorproef"). Haemolytisch Systeem MSB ( ^oor-proef"0 ) Zie Schema pag. 212. 1°. Plaats onder de resp. buisjes op de Kurkrekjes de serum verd. 2°. Maak nu de verd. van de Sera (imm. ser. en Norm. ser.) precies zooals het Schema aangeeft, tot 1:20000 (zie voor Techniek gebruik pipet pag. 150 enz.). Het verdient aanbeveling eerst zooveel mogelijk het serum in de buisjes te doen, vervolgens achter elkaar de NaCl toe te voegen. 3°. Doe in ieder buisje der „Hoofd-proef" 1 deeltje der resp. serumverdunning. Pipet telkens tusschen in doorspoelen (. b^oeft niet onder kraan, \ Vin reageerbuis is voldoende,/ 4°. Voeg vervolgens 1 deeltje Bac.-suspensie toe. 5°. Maak de Complement-verd., zooals in „voorproef" staat (pag. 205). Hier dus 5:100 \ 4:100 I Zie voor 3 :100 (controles ) T«hniek pag. 205 6°. Voeg in buisjes de gevonden Complement-waarde. 7°. Vergeet de Controles niet (zie Schema) doch zonder MSB. r„„imU I , . , „ I ) I Om te zien of de Bloed- Controle I = Zoutsolutie + ) Haemol. Systeem suspensie zonder Compl. I J I „intact" blijft. Controle II _ Ser. 1:10 +/ 1 Om te zien of het serum | " « | geheel Complement I J «vrij" is. „minim." hoeveelh. I | Controle III = Compl. = C (3) + { » >. } °m te zien of de" hoe- (zie Voorproef reeks I) ^ J veelheid C nog juist is. Ser. 1:10 + hier Controle IV = minim. hoeveelh. + „ 0m te zien of ser. 1:10 Compl. = C (4) n°g 1 dosis Complement (zie Voorproef reeks III) bindt. Bac. susp. + hier ^ Controle V _ minim. hoeveelheid + „ °ra te zlen of Bac-S"s- Compl. = C (4) " pens,e nog 1 dosis Com- (zie Voorproef reeks II) pIement bindt Schema der Imm. ser. en Norm. ser. verdunningen. Verklaring der Teekens B =1 deeltje Bacillen-Suspensie. Z =1 deeltje Physiologische Zoutsolutie. ® = i deeltje Imm. serum verd. 1:10-1:50. 1:50 = geen Complement-binding, dus Haemolyse. + s= wel „ „ geen Haemolyse. 8°. Meng de Reactie met „platina-naald"; van achteren af aan beginnen naar voren toe, dan behoeft men niet telkens uit te gloeien (zie pag. 173). Denk hierbij aan de „Controles" (tusschen Controles uitgloeien). Werk de luchtbelletjes tevens naar boven. 9°. Plaats proef bij 57° C. voor 1 uur, opdat „binding" van Complement kan plaats vinden. NS 1:10 _ . . 1-50 deeltje Normaal ser. verd. 1:10-1:50 C 4 =1 deeltje Complement verd. 4:100. "SB = 2 deeltjes Haemolytisch Systeem MSB 10°. Voeg daarna 2 deeltjes MSB toe. Meng goed met platina-naald. 11°. Plaats de proef ± 3/4 d 1 uur bij 37° C. Zoolang totdat de Haemolyse niet meer voortschrijdt, dit is meestal na 3/4 a 1 uur het geval. Het Aflezen der Proef. Zie voor beoordeeling der „Haemolyse" Schemata op pag. 200. Hier wordt de grens der Haemolyse niet zoo scherp getrokken; buisjes waarin ± de helft dtr Bloedlich. zijn opgelost, kunnen nog mede rekenen (±). Het Norm. Ser, zal in alle buisjes Haemolyse geven geen Complement gebonden Het Imm. Ser. geeft remming der Haemol. tot 1:2500 (wel Complement gebonden) reactie | negatief reactie positief Zoo ja, dan deugt of de mag geen Zoutsol. niet (te laag %) Controle I = Zoutsolutie + Haemol. Syst. Haemolyse 0f <]e buis is „vuil" of geven de Bloedlich. zijn „oud". i I mag geen 200 Ja> dan is serum Controle II = Ser. 1:10 + J „ 1 Haemolyse niet voldoende geinig J geven activeerd. { | moet wel Zo° niet> dan is Com" Haemolyse plement achteruit j geven gegaan. Ser. 1:10 + hier ( 1 moet wel Controle IV = „minim." hoeveelh. + < „ „ / Haemolyse Idem Compl. = C (4) l J geven Bac. Susp. 4- hier moet wel I Controle V = „minim." hoeveelh. + „ „ Haemolyse e"' Compl. = C (4) geven || Zijn de „Controles" niet intact, zoo is de proef . waardeloos". Het Phenomeen van Neisser-Wechsberg kan zich ook hier vertoonen als een „remming" bij de sterkere serum-concentraties (zie nog bij Agglutinatie, pag. 176). oorzaak hiervan zijn „stoffen" in het serum die tijdens de Immunisatie kunnen optreden (meestal praecipitinen) welke, wanneer zij tamelijk geconcentreerd aanwezig zijn, Compl. gaan „binden". Er blijft dan te weinig Complement over voor het „Amboceptor-Antigeen" complex, gevolg is „remming" der reactie. Bij de „hoogere" serum-verd. worden deze „stoffen" voldoende verdund, om niet meer storend op te treden. Theorie der Methode. De „Complement-bindings" reactie wordt aangewend daar, waar de andere Immuniteits-reacties (Agglutinatie—Praecipitatie—Bacteriolyse enz.) moeieiykheden opleveren of in den steek laten (Tuberculose, Gonorrhoea, Kinkhoest, Streptokokken, Anaerobionten enz. enz.) Bij organismen dus, die óf door hun consistentie bezwaarlijk een „homogene" suspensie geven, öf het vermogen missen, om behoorlijk „uit te vlokken" (zie bij Agglutinatie, pag. 176). Een ander groot voordeel ligt nog hierin, dat als Antigenen, even goed Extracten (van Bacteriën, weefsels, vochten, enz.) kunnen worden gebruikt. Zoo b.v. bij ziekten, waar een „filtreerbaar-virus" als aetiologisch moment moet worden aangezien en men vanzelf op weefsel-extract is aangewezen (Mazelen, Roodvonk, Polyomyelitis, Vlektyphus, enz. enz.). Of waar het aetiologisch moment bekend is, doch waar het „kweeken" van het oorzakelijk organisme technisch nog zeer bezwarend is (Syphilis, Spirochaeten, Lepra, Trypanosomen, Schimmels, Malleus, Echinococcus enz. enz.). De „Compl. Bind. reactie" wordt als „Quantitatieve" Reactie gebruikt, ingesteld tegenover de „minimale" hoeveelheid Complement. Hierboven (zie pag. 212) is de proef zoo ingesteld, dat het Imm. Ser. de quantitatieve reeks vormt (dalende hoeveelheden), tegenover een Stabiele-Complement en Stabiele Antigeen hoeveelheid (I). Dit (I) doet men bij voorkeur, omdat het er hier meestal omgaat alle eigenaardigheden van het betreffende Serum te leeren kennen, dus niet alleen de Amboceptoren, doch ook het verschijnsel van Neisser-Wechsberg, de verhouding tegenover „aanverwante" organismen enz. enz. Men zou het zich echter even goed kunnen denken, dat het Imm. Ser. stabiel bleef, terwijl het Antigeen de quantitatieve reeks zou kunnen vormen (dalende hoeveelheid) (II). Ook is het denkbaar, dat èn Antigeen, èn Imm. ser. stabiel blijven, doch het Complement de quantitatieve reeks geeft (III) (dalende reeks, uitgaande der „minimale" hoeveelheid). In Principe blijft, ondanks deze „verschuivingen" de reactie overal gelijk. Schema: I Antigeen Imm. serum Complement Haemolyt. SystJ MSB j Indicator II Antigeen Imm. serum Complement Haemolyt. Syst.) MSB j Indicator III Antigeen Imm. serum Complement Haemolyt. Syst.) . „ MSB < Indicator Omtrent het principe der Compl. Bind. Reactie werd reeds op pag. 188 in hoofdzaak alles gezegd. Hier volgen nog eenige meer physisch-chemische bijzonderheden: De Compl. Bind. Reactie verloopt ook in 2 Phasen: Phase I {Antigeen Imm. Ser. Complement 1 uur btf 370 C. Waar het Complement gelegenheid krijgt, zich door het „Amboceptor-Antigeen" Complex te laten binden. Voorwaarden hiervoor zijn: a. Compl. in „minimale" hoeveelheid aanwezig opdat het in zyn geheel kan worden geadsorbeerd. b. Dat voldoende tyd gelaten wordt, om de „binding" volkomen te doen zijn. c. Een temp. (370 C.) welke de Compl. binding bespoedigt. Phase II Toevoeging van Haemolytisch j Systeem MSB Indicator ± 45 min. btf 370 C. Om het eventueele Compl. verlies, dus het al of niet optreden der Haemolyse aan te toonen. Hoe „sterker" de sensibilisatie, m.a.w. hoe meer Amboceptoren zich aan het Antigeen kunnen hechten, des te minder Compl. js er noodig om de reactie tot stand te brengen en des te energischer wordt het Compl. gebonden; dit gaat parallel. Vandaar de groote „gevoeligheid" van het „maximaal" gesensibiliseerde Bloedmengsel van Sormani. Bij de Agglutinatie vindt men het Analogon: hoe sterker de „belading" met Agglutinine, des te kleiner de quantiteit Electrolyt (zout) noodig voor de „uitvlokking". De adsorbtie van Complement is ook hier op te vatten als een „condensatie" ervan op het „Amboceptor-Antigeen" complex, waarvoor de juiste physischchemische constellaties over en weer aanwezig moeten zijn; hier dus ook weer een „colloïdalen" evenwichtstoestand. De physiol. Zoutsolutie speelt ook hier een bijzondere rol: Er kunnen in het serum „remmende" stoffen optreden, afkomstig van Albuminoiden, welke waarschijnlijk als „Schutz-colloïden" fungeeren, zich a.h.w. plaatsen tusschen het Complement en het „Amboceptor-Antigeen" complex in en daardoor de Compl. adsorbtie tegen gaan. Zijn de sensibilisatoren (Amboceptoren) niet sterk genoeg om deze „remming" te overwinnen, zoo treedt de „reactie" vertraagd op. De Zoutsolutie verandert nu dezen „colloïdalen" toestand, heft de „remming" op, waardoor de Compl. adsorbtie ongestoord voort kan gaan. De Reactie van Von Wassermann. (Serologische Syphilis Diagnose) volgens B. P. Sormani.1 Principe der Reactie: Waar de Wassermann'sche „reactie" niet anders is, dan een Complement-bindings reactie, leze men dus eerst pag. 188 tot 215. Het grond-principe der Wa-reactie is analoog aan dat der Reactie van Bordet-Oengou. Waar reeds Gengou aantoonde, dat evengoed als de intacte cellen (Bac. suspensies enz. enz.), Extracten, en wel van de meest uiteenloopende stoffen (eiwitten, melk, serum, weefsels, lichaamsvochten, Bacteriën enz.) zich respec. als Antigeen iaten gebruiken, hebben Wassermann-Neisser en Bruck (1906) deze vondst, welke zij reeds in 1905 konden bevestigen aan Extracten van Bacteriën (Typhus, Tuberculose, Meningitis), getoetst aan de diagnostiek der Syphilis, waar er hier van Syphilis Spirochaeten als Antigeen, wegens de /z/'é^-kweekbaarheid, geen sprake kon zijn. Daarmede is de Compl. bindings reactie, welke tot nu toe slechts van groote theoretische waarde bleek, rechtstreeks in de kliniek gebracht. 1) B. P, Sormani. Archif für Dermatologie & Syphilis. Bd. CXVII1 Hft 1 1913. „ Münch. Med. Wochenschrift No. 2 1914. „ Dermatologische Wochenschrift 1916 No. 17, 18, 19. Harald Boas. Die Wassermann'sche Reaktion. Verlag van S. Karger, Berlin. Voorbeeld: Wanneer Extracten van Luetisch-materiaal (Organen, beenmerg, Condylomata, Papels, Qummata van Syphilitisch gemaakte apen of van Congenitaal luetische kinderen), samengebracht werden met Serum (geïnactiveerd) van Syphil. Apen (Syph. Amboceptor) + Complement + later (Haemolytisch syst.), zoo werd er Complement gebonden, een „binding" die uitbleef, wanneer óf Antigeen öf Serum niet luetisch was. De reactie bleek dus voor Lues „specifiek". Schema: A Extr. van . . Syphil. organ. (An«'gee") < Syphil. Apen ser. (geïnactiveerd) 1^ . . versch norm. Complement serum Amboceptor (geïnactiveerd) + Schapen-BIoedlich. 7^ is! / Antigeen Geen Haemolyse S + Complement gebonden ) Inim. ser. zijn \ Homoloog B Extr. van Syphil. organ. Syst. I 5 % Bloedlich. J M S B B. 1 deel Antigeen (sterkste dosis) , j ""Tl in dalende Complement | hoeveelhejd ( Amb°"pt°l ) Haemolyt. 2 dln (geïnactiveerd) Syst l 5 % Bloedlich. ) M S B Voor de eigenlijke „uitvoering" der Voor-proef zie men dadelijk pag.223. De Extract (Antigeen) verdunningen. a. Pipet van 1 ccm. in 100 deelen verdeeld. (Jtensiliën: b. Kurk-rekje met + 6 Agglutinatie-buisjes. C. Physiologlsche Zoutsolutie (0.85 % NaCl. in water). Verdunningen: hoeveelheid voor ± 15 Reacties. ccm. ccm. ccm. ccm. ccm. Extract 0.25 0.19 0.13 0.07 0.01 Zoutsolutie 0.75 0.81 0.87 0.93 0.99 25 :100 19 :100 13 :100 ! 7 :100 j 1 :100 De Complement-verdunningen. a. Serologische Pipet, zie pag. 147. Utensiliën: b. + 10 Agglutinatiebuisjes (Type A pag. 154) in Kurk-rekje. C. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in water). Het onverdunde, versch ontnomen Complement (zie pag. 195) wordt eerst 10 X verdund = }verd. 1 • 10 Van verd. 1:10 worden nu onderstaande verdunningen samengesteld (met serologische pipet). Hoeveelheid voor 9 Reacties: 8 : 100 8 deeltjes Compl. + 2 deeltjes Zoutsolutie 7 : 100 "/ -r 3 6: 100 6 „ „ + 4 „ „ 5 : 100 5 „ „ + 5 „ „ 4 : 100 4 „ „ + 6 „ 3 : 100 3 „ „ + 7 „ 2 : 100 2 „ „ + 8 „ 1:100 1 „ „ +9 „ in alle buisjes eerst het Complement, vervol> gens achter elkaar de Zoutsolutie toevoegen. Plaats de Compl. verd. onder de Buisjes op het Rekje. Voor „grootere" quantiteiten Complement (groot aantal Reacties): Onverdund Complement 6 gewone Reageerbuizen Pipet van 1 ccm. in 10 deelen verdeeld „ „ 10 ccm. „ 100 „ „ ccm. ccm. ccm. ! ccm. ccm. ccm. Complement 0.6 0.5 0.4 I 0.3 0.2 0.1 Zoutsolutie 9.4 9.5 9.6 j 9.7 9.8 9.9 0.06 o.os; 0.04 0.03 0.02 0.01 Haemolytisch-Systeem MSB j Indicator. Zie voor Bereiding en Techniek pag. 203. Techniek der Complement-Titratie. a. Gegradueerde Serologische Pipet (zie pag. 147) b. 2 Kurk-rekjes met ieder + 8 Agglutinatie-buisjes) Type A pag. 154 ƒ zelve 1 1 voor de in »» »» n ± o „ n v, Extract Utensilien: ƒ verd, i , IA 1 voor de 99 m » ± 10 ft „ > Compl. J verd. C. Physiologische Zoutsolutie (85 % NaCl in Water). d. Dunne Glas-staaf \ Doornede 2 mM. 1 > Lang 10 cM. ) met „stomp" uiteinde. Reagentia: Antigeen, verd. 0.25 tot 0.01 (zie pag. 222) Complement, verd. 6 :100 tot 1:100 (zie pag. 222) (even voor de proef bereiden) Haemolytisch-Systeem MSB (zie pag. 203) Schema der Werkwyze: 1°. Dag te voren: Buisjes en Rekjes klaar maken en resp. verdunningen duidelijk op rekjes plaatsen. Waterbad 56o C. in orde maken. 2°. Des ochtends vroeg: Geitenbloed afnemen en „wasschen" (zie pag. 193). 3°. Amboceptor bereiden (10-titer eenheden) zie pag. 204. 4°. Haemolytisch-Systeem by elkaar voegen en 2 uur by 37» C. (zie pag. 204). 5°. Sera Inactiveeren H uur bij 560 C. zie pag. 192 (indien dit niet reeds is geschied). 6°. Complement afnemen en Centrifugeeren (zie pag. 195). 7°. Extract-verdunningen maken (zie pag. 222). 8°. Complement „ „ (zje pag. 222). 9°. 1ste gedeelte „Voor"proef, 1 uur bij 37» C. (zie pag. 225). 10°. Haemolytisch-Systeem „wasschen" en MSB maken (zie pag. 204). 11°. 2de gedeelte „Voor"proef, bij 37» C. (zie pag. 225). 12°. Sera (Liquores) verdunnen (zie pag. 219). 13°. *Hoofd"proef (zie verder). A. De Amboceptor mag „niet meer" dan C2-C3 noodig hebben (zie Reeks I) B. Meer dan 2 C „eigen binding" zyn niet toegestaan (Reeks II). C. Er mag „geen" Agglutinatie der Bloedlichaampjes optreden. Verklaring der Teekens E 25 — 1 deeltje Extract verd. 0.25 C6 C 5 __ ^ ^geitje Compl. verd. 6:100—5:100 enz. enz. Z =1 deeltje Physiologische Zoutsolutie. M S B | = 2 deeltjes Haemolytisch Systeem MSB — = geen Compl. Binding, dus Haemolyse. -f- = wel „ „ geen Haemolyse. Plaats de Rekjes precies achter elkaar. Gebruik serologische Pipet. 1°. Breng in alle buisjes van Reeks II de Extract-verd. \ om de reactie 2°. „ ,, „ „ „ Reeks I en II de Zoutsolutie j op 5 deeltjes te * " n " i brengen, zie ' „Hoofd"proef. 3°. „ „ „ „ „ Reeks I „ II de Compl. verd. Eerst alle buisjes met Cl, dan van C2 enz. enz. 4°. Vergeet de „controles" niet (zie schema) doch zonder MSB. Controle f I üm te zien ot de B,oed" = Zoutsolutie -f- {Haemolytisch Syst. > susp. zonder Complement Reeks I J || „intact" blijft. ( \ Om te zien of het Extract controle _ Extract + J ># , l de Bloed-susp. Reeks II ^ J intact" laat. 5°. Meng met glas-staafje; van achteren af beginnen naar voren toe (zie pag. 173). Telkens afvegen tusschen iedere nieuwe reeks; werk de „luchtbellen" tevens naar boven. 6°. Plaats de proef 1 uur bij 37° C. opdat „binding" van Complement kan plaats vinden. 7°. Voeg daarna 2 deeltjes MSB toe. Meng goed met glas-staafje. 8°. Plaats de proef ± 3/4 d 1 uur bij 37° C. Zoolang totdat de Haemolyse niet meer voortschrijdt; dit is meestal na 3/4 k 1 uur het geval. Het aflezen der „Voor^proef. Zie voor beoordeeling der „Haemolyse", schemata op pag. 200. De grens wordt hier op dezelfde wijze getrokken: alleen het buisje waar volkomen „haemolyse" is opgetreden, moet als grens-waarde worden aangenomen. Meer dan 2 dosis Compl. „eigen-binding" zijn niet toegestaan. Reeks I = De „minimale" hoeveelheid Compl. voor het Haemolytisch- Systeem ligt hier by 3 Reeks II = By het Extract ligt de grens by C 4 Er is dus 1 C gebonden. Controle f I mag ®een Reeks 1 = ^ou'so'u"e + | Haemolyt. Syst. j Haemolyse ( J geven Zoo ja, dan deugt of de NaCl niet (te laag %) of de buis is „vuil" of de bloedlich, zijn „oud". Controle I I mag geen Reeks II Extract + „ " ( Haemolyse V I geven. Zoo ja, dan is het Extract Haemolytisch Zijn de „controles" niet „intact", zoo is de proef waardeloos. Benoodigde hoeveelheid Complement voor „Hoofd"proef: Antigeen bindt 1 extra dosis C „Minimale" hoeveelheid voor Haemolyt. Systeem C 3 Totaal C 4 De „Hoofd" Proef. (Eigenlijke „quantitatieve" Reactie). acnema: Serum-Proef. Controle-Proef. 1 deel Extract (hoevtl?he1d) 1 deel Extract (hoeve'Theld ) 1 deel Luetisch Ser. (5ge*nJtYvtrd) 1 deel Normaal Ser' (ge^actYvlerd) I————1 „Minira." hoeveelh. | „Minim." hoeveelh 1 deel Complement in „voor"proef 1 deel Complement I in „voor' proef gevonden (C 4) 1 bepaald (C 4) Extract Crontrole-Proef. Serum Controle-Proef j ^uis^'6 1 deel Extract (hoeveelheid) 1 deel Zo«^olutie 1 deel Zoutsolutie 1 deel Zelfde Ser. (geïnactiveerd) .Minim." hoeveelh. [——— „Minim. hoeveelh. v00r Haemol. Syst. 1 deel Complement in „voor"proef be- 1 deel Complement zie voor"proef paald Reeks II (C 4) L^_—Reeks I (C 3) Techniek der „Hoofd" Proef. a. Serologische, gegradueerde Pipet, zie pag. 191 b. 1 Kurk-rekje met ± 8 Agglutinatie-buisjes | voor Reactie Type A pag. 154 J Norm. Ser. 1 Voor zeker 1 » » + 8 » "I Luetisch ser. I Voor Patienten Utensiliën: 1 » » ±8 » "I Ser- x- I Voor Extract 1 n » ± 8 >» " I Controle C. Physiologische Zoutsolutie (0.85 % NaCl in Water.) d. Dunne Glas-staaf ) J-ang 10 cm. ' Doorsnede 2 mm. | ^ met „stomp" uiteinde Reagentia: „Normaal ser. 5 x verd. Isdi. Zoutsi. Extract verd. 0.25 tot0.011. reeds gereed geïnactiveerd J zie pag. 219 ƒ uit „Voor"proef Zeker Luet. „ 5 X , Complement (onverdund, uit het Ijs; reeds geïnactiveerd gereed uit „voor"proef.) „Patienten" X„ 5 X „ „ „ Haemolytisch Systeem MSB (reeds ge- geïnactiveerd reed uit nvoor..proef). Schema der „Hoofd"proef. Men late altoos een zeker Lnet. en een Normaal Serum mede loopen. NS5 = 1 deeltje 5 X verd. Normaal ser. L S 5 =1 „ 5 X .. Luetisch „ S X 5 =1 „ 5 X n Patienten „ X Verklaring E 25 Extract verd. 0.25—0.19 enz. der E19enz" Teekens C 4-3 = 1 „ Compl. verd. 4:100—3:100. Z = 1 „ Physiologische Zoutsolutie. M S B j = 2 „ Haemolytisch Systeem MSB •• = geen Compl. Binding, dus Haemolyse. 4- = wel „ „ geen Haemolyse. Plaats de Rekjes precies achter elkaar. Gebruik steeds Serologische Pipet. 1°. Breng in de Buisjes de respec. Serum verd. (zie schema). Spoel pipet uit tusschen iedere nieuwe reeks. 2°. Voeg vervolgens toe 1 deeltje der resp. Extract verd. Eerst alle buisjes met 0.25, dan met 0.19 enz. enz. 3». Maak de Complement-verd., zooals die in „Voor"proef gevonden zijn, zoo spoedig mogelijk: 6:100 \ Hier dus 4:100 < ^.e voor 3:100 (controles) ) Techirfek pag. 205. Laat men Serum + Extract te lang samen, voordat het Compl. wordt toegevoegd, zoo heeft men kans op „onspecifieke" bindingen. 4°. Voeg in ieder Buisje 1 deeltje der respec. Compl. verd. toe. , ... , , j- . I om alles op 5 deeltjes 5°. Voeg de deeltjes Zoutsolutie toe } te brengen 6°. Vergeet de „Controles" niet (zie schema) doch zonder MSB. Sera 5 1 *e zien °* .^e = -minim" hoevee,h' Compl. = C (3) + | Haemol. Syst. . Sdü,g vafcompl!" Reeks I-II-III ^zje voorproef reeks I) \ J vertoonen. Controle __ „minim." hoeveelh. Compl. = C (3) + j ^ ^ 1 hoèveelhe?d°Cdnog Reeks IV (zie Voorproef reeks I) I "I juist is. 7°. Meng met glas-staafje, van achteren af beginnen naar voren toe, (zie pag. 173). Telkens afvegen tusschen iedere nieuwe reeks. Werk de „luchtbellen" tevens naar boven. Plaats de proef 1 uur bij 370 C., opdat „binding" van Complement kan plaats vinden. 8°. Voeg daarna 2 deeltjes MSB toe. Meng goed met glas-staafje. 9°. Plaats de proef ± 3/4 a 1 uur bij 370 C. Zoolang totdat de Haemolyse niet meer voortschrijdt, dit is meestal na 3/4 è 1 uur het geval. Het Aflezen der „Hoofd" Proef. (Vastst^e'\ van den Syphi- litischen Index.) Hier wordt de grens der Haemolyse niet zoo scherp getrokken; buisjes waarin + de helft der Bloedlichaampjes zijn opgelost, krijgen' een ± en rekenen mede. 2: -I Bepaling Ieder + = een waarde van 0.2 ! Compl.-binditig » ± = » ,, „ 0.1 J Dubieuse „ » — = „ „ 0.0 } Geen Interpretatie Buisje 6. Buisje 6 der reactie bevat 2 dosis C meer dan de „hoofd" dosis; dit dient om onderstaande rede: Enkele, niet-luetische sera geven wel eens een weinig „zelf-binding", welke echter zoo gering is, dat deze niet als „remming" in de serum-controle (buisje 7) voor den dag komt. Er is dan kans, dat een „dergelijke" zelf-binding in Buisje 1 een zwakke remming, m.a.w. een zwak-positieve reactie geeft. Om een indruk te krijgen of men bij een dubieuse, zwakke reactie in Buisje I, inderdaad met een echte Complement-binding te doen heeft, dan wel of deze „remming" slechts door het serum alleen wordt veroorzaakt, kan men een extra buisje (6) nemen met overmaat Complement. Treedt hier ook remming op, dan is het een argument om inderdaad het bestaan van een geringe Complement-binding (dus een zwak-positieve reactie) aan te nemen (de Negri). Resultaten: Reeks Normaal Serum = 5 — 5 X 0.0 = 2 "I °/io (negatief) „ Luetisch Serum = 5 + 5 X 0.2 = 2 "I 10/io (sterkpositief) » ser. X = 2X + 2XX 0.2 = 21 5/io (positief) „ Extract-Controle = 5 — 5 x 0.0 = 5-1 °/,0 (negatief) Controle _ Sera 5 + „minim." ( 1 moet wel II Zf00 "iet, dan_ be- Reeks l-II-III - hoeveelh. Compl. + Hacmo1- Syst" Haem°'yse ^ ^Sn^Compl'. ' > Beven || door het serum. Controle _ „minim." hoeveelh. f I moet we' Zot> niet' dan is Reeks IV - Complement C (3) + ) " » f Haemolyse Compl. achteruit ^ J geven gegaan. Zijn de Controles niet intact, zoo is de proef waardeloos. Bepaling „Zelf-remming"' („binding") van Serum (Liquor). Controle van Reeks I-II-III (buisje 7 zie pag. 227) dient om te zien of het Serum als zoodanig Complement bindt. Treedt geen Haemolyse op, zoo is deze „geremd", en is er C gebonden; er moet nu worden nagegaan hoeveel Compl. het respec. serum „aan zich" gebonden heeft. De „Hoofd" proef van die reeks is dus waardeloos geworden door een „te weinig" aan Complement en moet nu worden overgedaan met zooveel meer Compl. als het serum voor zich alleen bindt. Bij deze proef moet worden nagegaan: A. De „minimale" hoeveelheid Complement welke het Haemolytisch Systeem als zoodanig noodig heeft (dit moet opnieuw gebeuren, aangezien het Complin die enkele uren achteruit gegaan kan zijn). B. De juiste hoeveelh. Compl. welke het Serum als zoodanig voor zich bindt. Schema: Complement-Titratie. Idttl | Complement | 2 -...{"""iT.8"'} Indicator Serum-Proef. 1 deel „Zelf-remmend" ser. (|e^cet#;) , , , I „ , ,1 in dalende 1 deel I Complement I ,, . | hoeveelheid RS 5 = 1 deeltje „Zelf Remmend" serum 5 X verd. C6-C 5 = 1 deeltje Complement verd. 6:100-5:100 enz. Verklaring der Z =1 deeltje Physiologische Zoutsolutie. Teekens M SB J = 2 deeltjes Haemolytisch-Systeem M S B — = geen Complement binding, dus Haemolyse. -f = wel „ ,» geen Haemolyse. De Compl. verd. moeten opnieuw worden gemaakt (zie pag. 222). Technisch wordt deze proef precies uitgevoerd als „Voor" en „Hoofd" proef. Het Aflezen der Proef. Reeks I = De Complement waarde ligt hier bij C 3 d i ii ^ A c «.» e I Het serum bindt Reeks 11 = „ „ „ voor het Serum bij C 5 > . _ _ I dus 2 C „Hoofd" proef met „Zelf-remmend" Serum. Benoodigde Complement hoeveelheid : „Minim." Compl C 3 (zie reeks I) „Zelf remmend" ser C 2 bindt Antigeen bond oorspronk. . C 1 (zie „voor" proef reeks II) Totaal C 6 De „Hoofd" Proef luidt nu als volgt: Contr 1 deel E 25 — E 19 — E 13 — E 7 — El — Z 1 deel R S 5 — RS5 — RS5 — RS5 — RS5 — R S 5 1 deel C 6 — C 6 — C 6 — C 6 — C 6 - C5 1) 2 dln. MSbJ — MSb|—MSbJ — MSbJ—MBsj — MSbJ Hoe verscher de Sera — hoe minder kans op „zelf-remming." „Deugdelijkheids" Bepaling van „nieuw" Extract. Het Extract (Antigeen) moet aan de volgende eischen voldoen: 1°. Het Extract mag niet „Haemolytisch" zijn. Extr. alleen met Bloed-susp. mag de Bloed-cellen niet oplossen (dan wegwerpen!) 2°. Het Extract mag niet te „sterk" zijn. 3°. „ „ „ „ „ „zwak" „ Voor ieder „nieuw" Extract (zie voor bereiding pag. 220) moeten langs zuiver „empyrischen" weg, de juiste waarden worden gevonden, als maatstaf nemend, een bestaand, goed werkend Extract, dat ter vergelyking steeds bij de proef betrokken wordt. De beide „uiterste" waarden van het Alcoholisch Extract, liggen meestal bij: (zie pag. 221). 0.25 ccm 0.01 ccm. Norm. ser. reageert hier -■ Norm. ser. = —> „zwak" Luet. ser. „ „ -f „zwak" Luet. ser. = — „sterk" Luet. ser. „ „ -f + „sterk" Luet. ser. = + Hier tusschen komen dan nog 3 verdunningen, ieder zooveel minder als i/4 gedeelte van het verschil tusschen hoogste en laagste verdunning. 1) De „Controle" krijgt dus als C-dosis die van „Zelf-remmend" serum minus de dosis die het Antigeen oorspronkelyk bond (C 1.) Voorbeeld: Sterkste verd. Antigeen = 0.25 ccm. 0.24:4 = 0.06. zwakste „ „ — 0.01 „ Iedere opvolgende verd. moet dus "-06 minder bedragen, dan de vooraf" gaande, dus: A reek^" } 0-25 — 0,19 ~ 0-13 ~~ 007 ~~ 0,01 ccm- Techniek der „Titratie". Men laat nu het „nieuwe" Extract in bovenstaande verdunningen met het „bekende" Extract in „Voor"- en „Hoofd" proef precies gelyk „medeloopen", tegenover een groot aantal seras ) Dementia Paralytica „sterk" positieve Sera J Versche Lues II (Iste tijdperk) ' Congenitale Lues „zwak" positieve Sera { !^u,es , , , ) Behandelde Lues „Negatieve" Sera | Zeker geen Lues Nu kunnen volgende mogelykheden zich voordoen: A. „Bekend" Extract. „Nieuw" Extract. Luet. ser. A 2-1 10/i0 Luet. ser. A 2-1 8/10 Luet. ser. B 2-1 8/10 Luet. ser. B 2-1 5/10 Norm. ser. 2-1 °/10 Norm. ser. 2-1 °/10 Dit Extract blijkt dus te zwak, geeft te lage waarden. Men neemt nu als hoogste dosis: 0.27 0.01 of 0.33 0.01 De 3 tusschenliggende waarden berekenen volgens bovenstaand schema. B. „Bekend" Extract. „Nieuw" Extract. Luet. ser. C 2-1 5/io Luet. ser. C 2-1 8/|0 Luet. ser. D 2-1 2/I0 Luet. ser. D 2-1 5/i0 Norm. ser. 2-1 °/lo Norm. ser. 2-1 '/lo Dit Extract blijkt te sterk, geeft te hooge waarden en is „onspecifiek". 1 100 Extr. Verdunnen met Alcoh. > + J 10 alcoh. 96 % en opnieuw probeeren, anders weg werpen. Het „nieuwe" Extract mag dan eerst de plaats van het „oude" innemen, als blijkt dat het tegenover een groot aantal „sera" volkomen „specifiek" is en ,Juiste" waarden geeft. Theorie der Methode: De Wassermann'sche Reactie is gebleken een der meest gewichtige hulpmiddelen te zijn voor de Syphilis-diagnostiek. Vooropgezet echter, dat deze reactie, evenals die van BordetGengou, door hare theoretische en technische gecompliceerdheid, slechts in die handen thuis behoort, die haar door langdurige beoefening en groote ervaring volkomen beheerschen. De interpretatie der Reactie is zeer moeielijk, waar de Syphilis, al naar hare lokalisatie en al naar den aard en het tijdstip der Therapie, zeer verschillend daarop reageert. Het is hier niet de plaats daarop verder in te gaan, men zie daarvoor de specialistische literatuur. Onderstaand staatje, ontleend aan Ascoli, spreekt voor zich zelf: Syphilis in le Stadium Wassermann positief = 38.5—100 °/0 » 2e » » „ = 70.- —100 % » » ^e „ „ „ = 90.— 95 o/0 Progressieve Paralyse „ =90 % Tabes Dorsalis „ „ = 70.- — 80 »/„ De aard der Lokalisatie is tevens beslissend voor de keuze van het onderzoekings-materiaal, of Serum alleen, of Serum en Liquor moeten worden onderzocht. Alleen reeds het feit, dat Malaria, Scarlatina, Lepra, Framboezia Tropica, Ulcus Tropicum, een positieve Wa-reactie kunnen uitlokken, bewijst voldoende hoe gecompliceerd de beoordeeling ervan is. Voor de meer physisch-chemische grondslagen, zie men de Reactie van Bordet-Gengou pag. 214. Toch is er een principieel verschil tusschen beide reacties en wel: 1°. Bij de reactie van Bordet-Gengou is het Antigeen Specifiek. 2°- » .. >, „ Wassermann behoeft „ „ niet Specifiek te zijn. Het feit dat Extracten van normale organen (zie pag. 217) zelfs oplossingen van Cholesterine, Lezithine (Lipoïden) enz. als Antigeen kunnen dienst doen, bewijst de niet specificiteit ten duidelijkste en toch blijft ondanks dit alles, de reactie toch specifiek. De verklaring hiervoor is waarschijnlijk deze: De Wa-reactie moet niet als Immuniteits-reactie, strictu sensu worden opgevat, m.a.w. niet als Antigeen respec. Antilichaam welke op elkaar inwerken. Als dit zoo was, zou een Luetisch- serum de Lues-spirochaeten op eenigerlei wijze moeten beïnvloeden (Agglutinatie, Bacteriolyse, Phagocytose enz.) Dit nu is geenszins het geval, terwijl Imm. ser. verkregen door inspuiting met Lues-spirochaeten, wel degelijk op den eigenleken spirochaet inwerkt. Bij de Wa-reactie heeft men niet zoo zeer met „eiwitachtige" dan wel met „Lipoïdachtige ' colloïden te doen. Het Syph. Serum schijnt rijker aan Lipoïden te zijn dan het niet Syph. serum, waarschijnlijk tengevolge van afbraakproducten der gedestrueerde weefsels, waardoor vele Lipoïden in circulatie worden gebracht (Ascoli). Het Syph. ser., door zijn bijzondere „Lipoïd" affiniteit, geeft aan de Lipoïden van het Antigeen, door zich daaraan op bijzondere wijze vast te hechten, het vermogen Complement te binden. Hiervoor moet echter over en weer ook weer die juiste physisch-chemische constellatie aanwezig zijn, waardoor dien bepaalden „colloïdalen" evenwichtstoestand ontstaat, die de Compl. adsorbtie mogelijk maakt (zie pag. 189). De Amboceptoren van het Syph. ser. zijn dus niet op te vatten als een reactie tegen het ziekte makend agens (in casu spirochaeten), doch zijn veel meer het gevolg van, en een reactie op de „laesies" van het zieke weefsel. Want ware de Wa-reactie inderdaad het gevolg van een optredende Immuniteit, dan zou deze „sterker" moeten worden, naarmate de genezing voortschreed en een tijd lang blyven bestaan na de genezing (denk aan Agglutinatie enz.) Bij de Wa-reactie is het precies omgekeerd; deze verdwynt naarmate de „manifeste" verschijnselen (gummata, plaques enz. enz.), de weefsel-destructies ophouden of de genezing intreedt. De Wa-reactie moet dus worden opgevat niet als een Immuniteitsreactie, doch veel meer als een Lipoïd (colloïd) Chemische reactie, welke voor Syphilis „specifiek" is. Syphilis-Reactie volgens Sachs-Georgi. (Quantitatieve Methode A. J. Vitringa) Met eenige technische wijzigingen van M. van Riemsdijk. Principe der Reactie. Sachs en Georgi merkten op, wanneer uit een vloeistof „complement" verdwijnt, dit samengaat met de vorming van fijne, voor het bloote oog onzichtbare partiekeltjes, waarschijnlijk „uitvlokking van globuline". Het lag voor de hand dat de „complement-binding" welke in het lste gedeelte der Reactie van Von Wassermann optreedt, ook met een dergelijke „uitvlokking" zou gepaard gaan. Jacobsthal zag dan ook, wanneer het Extract (antigeen) der Wa-reactie (m.a.w. de alcoholisch geëxtraheerde „lipoïden") verdund met Zoutsolutie, werd samengebracht met Syphilitisch-serutri, een, eerst in het „donkerveld" (zie pag. 77) zichtbare „uitvlokking" zich vertoonde. Jacobsthal zag verder, ook weer microscopisch bij „donkerveldbelichting", dat een mengsel van Lues-antigeen en Luetisch Serum een grovere uitvlokking tengevolge had, dan Norm. Ser. en Lues-antigeen. Sachs-Oeorgi vonden nu een methode om deze „zwakke" doch „specifieke" uitvlokking zoo te versterken, dat zij voor het bloote oog zichtbaar werd; zij vonden daarvoor het Cholesterine, in samenwerking met Hart-Extract (Lipoïden), in een milieu van een bepaalde NaCl concentratie. Als alle „uitvlokkings-reacties" behoort de reactie van Sachs-Georgi tot de Colloïd-chemische reacties, waarvan de juiste verklaring nog in het duister ligt. Waarschijnlijk zijn het de Lipoïde stoffen van het Extract welke onder invloed eener bepaalde NaCl concentratie het vermogen hebben, de globulinen van het Luetisch serum uit te vlokken, terwijl de globulinen van het Normale serum onder dezelfde omstandigheden intact blijven. Ook hier zijn het dus over en weer fijn gebalanceerde colloïd-chemische constellaties, die tot elkaar in een bepaald evenwicht moeten staan, wil de „specifieke" uitvlokking tot stand komen. Bij de reactie van Sachs-Oeorgi, vertoont zich een nieuwe factor n.m. de snelheid waarmede het Electrolyt (NaCl) wordt toegevoegd. Een welfde colloïdale oploss. kan bij langzame toevoeging v/h Electrolyt intact blijven. » n n n uw snelle „ v/h „ uïtvlokken. By de Reactie van Sachs-Georgi is precies het „omgekeerde" het geval. Het tempo der NaCI-toevoeging is dan ook voor deze reactie van beslissend belang, aangezien daarmede de „gevoeligheid:' van het Extract ten nauwste samenhangt. Schema der Reactie: Cholesterine + Antigeen ) Cholesterine + Antigeen (£*£) Syphilitisch Serum (geïnactiveerd) Normaal Serum (geïnactiveerd) Physiol. Zoutsolutie Physiol. Zoutsolutie Uitvlokking Geen uitvlokking S. T. Bok en later A. J. Vitringa, hebben (om dezelfde rede als voor de Reactie v. Wassermann zie pag. 220) deze oorspronkelijke qualitaticve reactie in een quantitatieve veranderd, de Indices van Sormani's methode op deze reactie toegepast (zie pag. 229). Zie voor Literatuur 1). Eenige Algemeene Wenken. De Reactie-buisjes. De reactie-buisjes voor „Voor" en „Hoofd"proef precies dezelfde als voor de Agglutinatie-reactie, Type A pag. 154. Kurkfesop de buisjes, zeer goed sluitend (desnoods caoutchouc kurkjes). 1) Sachs-Georgi, Med. Kiinik Nov. 1918, Münch. Med. Woch. 1919. A. J. Vitringa, Tijd. v. Vergelijkende Geneeskunde enz. Dl. Vil afl. 4 1922. A. J. de Nooy, Geneesk. Tijd. Ned. Indië, Afl. 2 deel 60, 1920. Reiniging der Buisjes. De reiniging der buisjes is uiterst gewichtig; aangedroogd eiwit, zure, of alkalische reactie, kunnen een positieve of negatieve reactie geven. Zie voor Reiniging pag. 155. De Rekjes: Aangezien hier de reactie niet macroscopisch, doch ieder buisje afzonderlijk in den Agglutinoscoop moet gebracht worden en dan bekeken, heeft het geen zin, iedere Reactie een afzonderlijk rekje te geven. Het eenvoudigste is de reacties (telkens 8 buisjes naast elkaar) rij aan rij in een vierkant kurk-plankje van 2 cm. dikte, te monteeren, b.v. 10 sera per plankje. oiasstaaf / zie voor Techniek der Vervaardiging pag. 156. met Knop voor handvat (zie pag. 156.) De gaatjes met Kurkenboor geboord, moeten zoo zijn dat de buisjes daaruit gemakkelijk te lichten zijn. Agglutinoscoop van Kuhne en Woithe In den handel, zie fig. pag. 250. Instrument voorzien van verstelbare Loupe van 6-voudige vergrooting, met spiegel-verlichting (verstelbaar) en zwart schermpje, waarmede „donkerveld-werking" wordt bereikt. De buisjes worden in het gezichtsveld gebracht, de loupe scherp gesteld en de reactie afgelezen (zie pag. 250). De Lichtbron j Het verdient de voorkeur de Agglutinoscoop met Kunstlicht te gebruiken. 100 Kaars lamp monteeren als op pag. 43 of in lampje van Reichert. De lichtbron wordt vlak voor den Agglutinoscoop geplaatst, zoodat er diffuussterk licht ontstaat. Proeven altoos aflezen met „dezelfde" lichtbron. De Pipetten. A. Serologische-gegradueerde Pipet in 10 (11) deeltjes verdeeld (zie voor vervaardiging en gebruik pag. 147). 1 pipet-deeltje ± l/2g ccm. B. Pipetten van 10 ccm. in 10 deelen verdeeld (in den handel). C. Pipet van 10 ccm. in 100 deelen verdeeld („ „ „ ). Patienten Sera en Liquores. Zie voor Bloed-afname en Bloed-verzending pag. 159- 162 191. Sera (zoo versch mogelijk ontnomen) worden bij aankomst van bloed-koek afgepipeteerd (zoo noodig eerst nog centrifugeeren), in Agglutinatie-buisje gedaan, goed dicht kurken, dadelijk geïnactiveerd en in Ijs-kast geplaatst. Zie voor Techniek enz. pag. 163. Sera. Voor de Reactie 10 X verdunnen. 1 deeltje Serum + 9 deeltjes Zoutsolutie \ met SeroIog'sche I Pipet Liquores. Liquor bevat geen Complement, behoeft niet geïnactiveerd. Op dezelfde wijze bewaren als de Sera. Voor de Reactie onverdund gebruiken. Het Inactiveeren (Complement „vrij" maken). y2 uur verwarmen bij 56° C. in Waterbad. Zie voor Techniek pag. 192. De Physiologische Zoutsolutie. De Zoutsolutie luistert zeer nauw. Men neme zuiver Keukenzout (magnesium-vrij). 0.85 o/0 NaCl in Aqua Dest. Beter niet steriliseeren, om verdamping te voorkomen. Het eenvoudigste is het Aqua Dest apart te steriliseeren en er dan het NaCl in op te lossen. RprpiHinv vfln FYtrarf /Zelfde Extract als voor de\ Dereiaing van net nxiracr. (_reactie van v Wassermannj 1°. V2 Koeienhart ontdoen van vet, peezen en vaten, zoodat de spierzelfstandigheid overblijft. 2°. Fijn malen in fijne vleeschmolen. 3°. Pro 1 gr. orgaan 5 ccm. Alcohol 96 0/0. b.v. 100 gr. orgaan + 500 ccm. alcohol, in stopflesch van 1 L. inhoud. 4°. Schudden ± 5 min. 5°. Na 3 dagen filtreeren. Dit Alcoholisch Hart-Extract in donker bewaren in flesch, met caoutchouc kurk dichtgekurkt bij Kamer-temp. Extract is lang houdbaar. Men bereidt zich 2 Extracten van 2 verschillende harten A en B. Proef ter bepaling van juiste verhouding Extract tot Cholesterine (Cholesterine-titratie) Ieder Extract vereischt zijn „eigen" hoeveelheid cholesterine, wil de „specificiteit" der reactie haar hoogste norm bereiken. Extract en Cholesterine moeten dus tot elkaar in een bepaalde, uitsluitend empyrisch te zoeken verhouding staan, als basis het sterk positieve Luetische serum aan den eenen kant, het normale en zwak positieve Luetische serum aan den anderen kant, tegenover een bestaand, goed werkend Extract ter vergelijking. De Proef verloopt in 4 Etappen: I gelijke deelen Extract samenbrengen met\ Extract-Cholesterine ongelijke „ Cholesterine ƒ mengsels II-1II 6-voudige verdunning der Extract-Cholesterine mengsels. Eerst 1 X yol. aan Zoutsolutie Dan 4 X n » } Zeker Luetische en Normale Sera in verhouding 1 : 2 Techniek der Proef. a. Serologische-gegradueerde Pipet (zie pag. 147) b. 2 Pipetten van 10 ccm. in 10 deelen verdeeld. C. Pipet van 10 ccm. in 100 „ „ Utensiliën: d. Maatglas van 100 ccm. Hetzelfde voor Extract B e. 5 Reageerbuizen met Kurken, in Rekje I J ^00r Extr' * I cholesterine e „ I Voorverd.Extr. A " » tl M «« II . i + NaCl ƒ. Kurkplankje (zie pag. 236) met Agglut. buisjes Type A pag. 154 Voor: Luet. Ser. -fExtr. A Voor: Norm. Ser. -fExtr. A g. nroedstoot 37<< C. h. Agglutinoscoop met Kunst-lichtbron (zie pag. 236). Reagentia: / % Alcoholische Cholesterine oplossing Cholesterine heeft 500 mgr. Cholest. + 50 ccm. Alcohol 100 % "aTlfJëfren'by'Llerê (zie voor bereiding 100 % Alcohol pag. 24) temp. Is dit zoo, plaats fleschje dan een paar uurtevoren bij 370 C. (goed afgesloten). Gebruik steeds bovenstaande vloeistof vrij van cristallen. Alcoholische Hart-Extracten A en B (zie pag. 238). „Luetische" sera (groot aantal) „Normale" sera (groot aantal) Alcohol-Zoutsolutie mengsel 1:5 ' 1 ccm" Alcoho1 96 % s ( 5 „ Zoutsolutie Physiologische Zoutsolutie (zie pag. 237) De reactie moet in een bepaalden, afgemeten tijd verloopen, n.m.: A Niet minder dan 3 uur Nadat het Extract is verdund met de Niet langer „ 4 uur NaCI (zie II-III), mag de proef met de gemiddeld dus 3H uur , Sera (IV) worden ingezet. Men noteere dus den tijd der verd. van het Extract precies. B Niet minder dan 2 uur moeten er verloopen tusschen het Inacti- De meeste sera zijn bij veer en en het verdunnen der Sera voor de aankomst reeds ge'inac- „ tiveerd geworden. „reactie (IV). Schema der Werkwyze (Voorbeeld). 1°. Extract-Cholesterine mengsels maken (I) zie onder. 2". 9 uur Sera M uur in Waterbad 56° C. ter Inactivatie. (Dit alleen wanneer er den dag zelf nog sera moeten worden geïnactiveerd). 3°. 9 uur Extr. Cholest. mengsels verdunnen met NaCl (1I-III) zie onder. t1.... « 1A v, . 1 Er is dus IK uur beschikbaar 40. 11 uur Sera 10 X verdunnen J> , . ' J voor het verdunnen der sera 50. 12.30 uur Extr. Cholest. mengsels -f- Sera in broedstoof 370 C. De Extract-Cholesterine Mengsels datn"egahoogstee zeker'te Men ga uit van 3 X verdund Extract A en B laa^f's''' laagste zeker te 20 ccm. Extr. A + 40 ccm. Alcohol 96 u/0 1 ln ' J maatglas Met pipet van 10 ccm. in 10 en 10 ccm. in 100 worden nu volgende combinaties gemaakt: Rekje I ccm. ccm. ccm. ccm. ccm. Hart Extract A 10 10 j 10 | 10 j 10 Cholesterine 1 % Q 5 0 g u M I 17 met pipet 10 ccm. in 100 5:100 8:100 11:100 14:100 17:100 Meng, door omschudden. II Mengsels 1 verdunnen met NaCl. Een gemeten hoeveelheid van bovenstaande Extr. Cholest. mengsels (1) verdunnen met 1 X onmiddellijk daarna met 4 X zelfde hoeveelheid Zoutsolutie (totaal 6 X verdund) als volgt: Rekje II ccm. ccm. ccm. ccm. ccm. Extr. Cholest. mengsels 11111 Hoeveelheid Extract 1X Volume aan Zoutsol. 11111 voor Plotseling toevoegen +90 Sera met nieuwe pipet Voor het toevoegen van de NaCl, neemt men iedere buis afzonderlijk in de hand en schudt dadelgk even, als de Zoutsolutie er in is gebracht. Van groot belang is het, deze lste hoeveelheid NaCl er altoos met dezelfde „snelheid?' in te laten loopen. Men gebruikt daarvoor steeds dezelfde pipet, in denzelfden stand. III ccm. ccm. ccm. ccm. ccm. 4 X Volume aan Zoutsol. . . . . 4 4 4 4 4 Plotseling toevoeging. Even schudden, buizen dichtkurken, 3(K) uur laten staan bij Kamer temp. Eenige wenken omtrent technische uitvoering II-III. Voor II gaat men als volgt te werk: Wanneer telkens 1 ccm. Extr. Cholest. mengsel wordt ingebracht, zij men er op bedacht de pipet nooit te spoelen tusschen de verschillende concentraties in (de alcoh. verd. van het Extract wordt daardoor grooter). De pipet wordt dus tusschen in flink uitgeblazen, afgeveegd van buiten en vertikaal op filtreerpapier afgedept. De Zoutsolutie-toevoeging onder II en III luistert zeer nauw: Men hevelt in de pipet de 5 ccm. NaCl, neemt buis in linkerhand en Iaat nu 1 ccm. precies tegen buiswand aan plotseling uitloopen, even schudden en meteen de 4 ccm. snel in laten loopen, en wederom even schudden. Men houdt de pipet zooveel mogelijk onder denzelfden hoek tegen den buiswand aan. De overige buizen worden evenzoo behandeld. Zooveel mogelijk voor allen in gelijkwaardig tempo de NaCl. toevoegen (dit luistert zeer nauw). Deze zelfde proef wordt eveneens gedaan met Extract B. De Serum-verdunningen: Sterk positieve Luet. Sera 1 Dement. Paralytica ~ I Versche Lues II Sera ' Zwak „ „ „ Normale Sera Sera worden 10 x verdund: 1 Met 2 deeltjes Serum + 18 deeltjes Zoutsolutie [> Seroiogische J Pipet Schema der Extract-Cholesterine titratie. 1 deel Extr' Cholest' ( in stijgende \ - . . Extr. Cholest. / jn stijgende \ mengsel A \ hoeveelheid / Mengel A V hoeveelheid / + + 2 dln. Luetisch Ser. ( gefaa^tfveerd) 2 dln. Normaal Ser. ( 10.X verdund^ Uitvlokking Geen uitvlokking. Ieder „nieuw" Extract laat men steeds „medeloopen" met een bestaand, goed werkend Extract; dit is de eenige maatstaf om het nieuwe Extract aan te keuren, aangezien de theoretische basis dezer reactie nog volkomen duister is. Schema: IV Extract A (B) Ieder buisje stelt voor 1 qualitatieve 8. G. reactie. Verklaring der Teekens ?T ^ =1 deeltje Extr. Cholest. A 5:100—8:100 enz. E A 8 enz. N S 10 J = 2 deeltjes Normaal ser. 1:10. L S 10 J =2 deeltjes Luetisch ser. 1:10. -f = vlokvorming (positieve reactie). — zz geen vlokvorming (negatieve „ ). Deze zelfde proevenreeks met Extract B, ook met een groot aantal positieve en negatieve Sera. Gebruik serologische Pipet. 1°. Breng eerst in de buisjes de respec. Serum-verd. Neem de geheele hoeveelheid serum van een reeks tegeiyk in serologische pipet (12 deeltjes). 2°. Breng vervolgens in de buisjes de respec. Extr. verd. Eerst alle buisjes met E A 5, dan met E A 8 enz. enz. Niet spoelen tusschen het overbrengen der verschillende Extr.Cholest. concentraties (pipet uitblazen en afvegen). 3°. Vergeet de „Controles" niet (zie schema). Controle 1 = Extr. Cholester. + Zoutsolutie Controle II = Serum 1:10 + Alcohol. Zoutsol. Om te zien of Extract met NaCl uitvlokt Om te zien of Serum met Alcoh. reeds uitvlokt 4°. Meng door buisjes ieder afzonderlijk te schudden. Vloeistof moet „opalescent" zien. 5°. Buisjes dichtkurken, vooral zorgvuldig. Doet men dit niet, zoo verdampt er relatief teveel en er ontstaan „onspecifieke" reacties. Proef 24 uur bij 37° C. Daarna 24 uur bij Kamer-temp. Het Aflezen der Proef. De buisjes worden ieder afzonderlijk in den Agglutinoscoop bekeken | na 2 X 24 uur. Er is zoo weinig vloeistof in de buisjes, dat bij „horizontale" ligging, de vloeistof in de punt achterblijft. Plaats de Kunst-lichtbron vlak voor Agglutinoscoop. 1°. Schuif ieder buisje in den Agglutinoscoop (C pag. 250), breng de vloeistof in het gezichtsveld, en houdt het buisje op de goede plaats, door aan de andere zijde van het Instrument een groote reageerbuis (B) te schuiven (bodem naar buisje toe). 2°. Stel loupe scherp (deze blijft dan voorgoed ingesteld). Zoek maximaal licht door middel van spiegel. Manoeuvreer met zwart schermpje (A) totdat donkerveldwerking ontstaat en lees het resultaat af. Resultaten: in den Agglutinoscoop: Negatieve—Sera Volmaakt Waterhelder In den Agglutinoscoop: Gelijkmatige, zeer fyne vlokking (sneeuwbui). 1 OSltieve—oera Bij wsterk" positieve sera zijn de vlokken wel eens „grover" doch „gelijkmatig". In den Agglutinoscoop: Vette bera ^ej eens troebel (geen beteekenis). In den Agglutinoscoop: Artefacten Vlokjes, verschillend van grootte en gering in aantal, geen diagnostische beteekenis (vuiltjes, enz.) Zijn de „Controles" niet intact, zoo is de proef waardeloos. Het blijkt nu, dat de grens van de juiste hoeveelheid Cholesterine niet scherp te trekken is, men veel meer met een „optimale-zone" van cholesterineering te doen heeft, gaande over verschillende verdunningen. Zoo strekt zich bij bovenstaand schema, de „optimale-specifieke zone" voor Extr. A uit over EA II—EA 14, „sterk" Luetisch ser. + waarbij „zwak" „ „ + reageert „Normaal" „ ■■ Mits men maar binnen deze „zone" blijft, kan men zonder gevaar de dosis cholesterine laten schommelen. Het beste is echter het „midden" der optimale zone te nemen, hier dus 100 + 12 of 100 + 13. Gaat men onder de laagste waarde, zoo is er kans „zwak" positieve sera negatief te vinden „ „ boven de hoogste „ „ „ „ „ op „onspecifieke" reacties. Andere mogelijkheden : Het volgende kan zich voordoen, hoewel dit zelden het geval is: I Geeft een Extract met veel „zwak-positieve" sera een negatieve reactie, zoo moet de „zone" gezocht worden bij wat hooger Cholesterine-gehalte: Voorbeeld: 100 100 100 100 100 Extr. Cholest. + + - + + 5 8 11 14 17 Norm. ser. — ■■ —■ ™ -h „sterk" Luet. ser. + -h + + + „zwak" Luet. ser. — — ™ ™ De proef wordt nu herhaald met „hoogere" Cholest. waarden b.v. 100 +15—100 +16. Treden er nu „onspecifieke" reacties op (Norm. ser. -f) terwijl de Cholesterineering voor „zwak-positieve" sera goed is, dan is het Extract onbruikbaar. II Geeft een Extract met „normale" sera uitvlokking, dan probeert men het met kleinere hoeveelheden Cholesterine. Voorbeeld: 100 100 100 100 100 Extr. Cholest. + + + + + 5 8 11 14 17 Norm. ser. — — + „sterk" Luet. ser. -f- -f- -f- -f- -f- „zwak" Luet. ser. — ™ -j- -f- De proef wordt nu herhaald met „lagere" Cholest. waarden b.v. 100-f9—100 -f 10. Geeft het dan te weinig positieve reacties, zoo is het Extract eveneens onbruikbaar. Het komt slechts zelden voor, dat een Extract geen „bruikbare" Zone blijkt te bezitten. Ieder extract heeft dus zijn „eigen" optimale Zone van Cholesterineering, welke steeds „afzonderlijk" voor ieder Extract moet worden bepaald. Samenstelling van het juiste Cholest.-gehalte van Extracten A-B. Voeg bij de Extracten A-B, die hoeveelheid Cholesterine welke in Voorproef is vastgesteld geworden (zie pag. 244). Maak hiervan voorraad, b.v. 50 of 100 ccM., in goed gesloten flesch, caoutchouc kurk bij Kamer-temp. bewaren, lang houdbaar (1 a 2 jaar). Extract wordt in „Hoofd" Proef gedurig gecontroleerd door de tegelyk aangestelde Reactie van v. Wassermann. Treden er nu plotseling groote verschillen aan den dag, zoo is het Extract veranderd en moet de Cholesterine-titratie (zie pag. 238) opnieuw worden ondernomen. De „Hoofd" Proef. „Eigenlijke"-Reactie (qualitatief en quantitatief). Schema: Serum.Proef. Controle-Proef. 1 deel Extr. Cholester A (B)\in «Voorproef" l deeI ^ Qho 1 in „Voorproef j bepaald * 'ƒ bepaald 10X verdund iox verdund Luetisch Ser. (qualitatief) Normaal Ser. (qualitatief) 1 aln- In dalende 2 dln. In dalende geïnactiveerd hoeveelheid geïnactiveerd hoeveelheid (quantitatief) (quantitatief) Techniek der „Hoofd" Proef: a. Serologische-gegradueerde Pipet (zie pag. 147). b. 2 Pipetten van 10 ccm. in 10 verdeeld. ... , « . • 1 Voor verd. C. 2 Reageerbuizen met kurken in Rekje > £xtr A ^ NaCJ }Voor verd. Extr. B + NaCl d. 1 Kurkplankje met 21 Agglutinat. Buisjes j 3 rijen van (pag. 236) Type A pag. 154/7 Buisjes voor met Kurkjes J Reactie zelve e. Broedstoof van 37° C. ƒ. Agglutinoscoop met Kunst-lichtbron (zie pag. 250). Reagentia: Extract (Cholesterine) A en B (geVèed^^pagl^e) „Normaal" serum (geïnactiveerd) „Luetisch" serum ( „ ) „Patienten" ser. X ( „ ) („Liquor") (ongeïnactiveerd) c 1 ccm. Alcohol 96% Alcohol-Zoutsolutie mengsel 1:5 5ccm. Zoutsoiutie. Physiologische Zoutsolutie (zie pag. 237). De reactie moet in een bepaalden, afgemeten tijd verloopen: A. Niet minder dan 3 uur 1 Nadat het Extract is verdund met de Niet langer „ 4 uur f NaCl, mag het met de sera worden samenbemiddeld dus 3H uur) ' gebracht. Men noteere dus den tijd der verd. van het Extract precies. B. Niet minder dan 2 uur moeten er verloopen tusschen het Inacti(de meeste sera zijn bij aankomst veeren en het verdunnen der sera voor reeds geïnactiveerd geworden) de „reactie". Schema der Werkwijze (Voorbeeld): lo. 9 uur. Sera H uur in Waterbad 56» C. ter Inactivatie (dit alleen, wanneer er den dag zelf nog sera moeten worden geïnactiveerd). 2». 9 uur. Extract verdunnen met NaCl (Il-III pag. 247). , ) Hiervoor is dus 30. 11 uur. Sera 10 X verdunnen j ^ uur beschikbaar 4°. 12.30 uur. Extract + Sera in broedstoof 37° C. _ „ , v - n . , «T /■>! eerst 1 X 00 \ Totaal Extr. (Cholester.) A en B verdunnen met NaCl. dan 5 ƒ 6X II. Zie voor Techniek eerst pag. 241. Extr. Cholester. A 1 ccm. Extr. Cholester. B 1 ccm. Hoeveelheid L ü Extract 1 X Volume aan Zoutsol. 1X Volume aan Zoutsol. voor Plotseling toevoegen 1 ccm. Plotseling toevoegen. 1 ccm. + §era met nieuwe pipet met nieuwe pipet Neem iedere buis afzonderlek in de hand, en schudt dadeiyk even, als de Zoutsolutie is ingebracht. Deze lste hoeveelheid NaCl er altoos met dezelfde „snelheid" in laten loopen, van groot belang (zie voor Techniek pag. 241). Men houdt daarvoor steeds dezelfde pipet in denzelfden stand. III. 4X Volume aan Zoutsol. . 4 X Volume aan Zoutsol. . 4 ccm. 4 ccm. Plotseling toevoegen Plotseling toevoegen || Even schudden, buizen dichtkurken. Laten staan 3 (y2) uur bij Kamer-temp. De „snelheid" van verdunnen van het Extract is van belang voor de gevoeligheid van het Extract. Men mag het Extract niet gevoeliger of ongevoeliger maken dan in „Voor"proef. Vandaar dat het verdunnen altoos met dezelfde snelheid moet geschieden. De Serum-verdunningen. De Serum-verd. luiden als volgt: 1:10 - 1 : 20 - 1: 40 - 1: 80 - 1:160 Daarvan wordt verd. 1:10 = Qualitatieve Sachs-Georgi (oorspronkelyke reactie). Daarvan worden verd.: 1:20 \ ! ' ^5? ) Quantitatieve Sachs-Georgi (Vitringa). 1:80 | 1:160 j De reactie als zoodanig zal nu gaan bestaan uit: 1 qualitatieve reactie = Ser. 1: 10 + Extract A (buisje 1) Dit om het Extr. 1 „ „ = Ser. 1:10 + „ B (buisje 6) > door 2e Extr. te J controleeren. 4 quantitatieve reacties = Ser. 1:20 | " !' oa / ~t. Extract A (buisjes 2-3-4-5) „ 1:80 I „ 1:160 ) Om te zien Alcohol ï of het Ser. Controle = Ser. 1:10 -f ^ . . > l:5(buisje7) alleen met Zoutso1- ƒ Alcoh. reeds uitvlokt Techniek der Serum-verdunningen: J met ^pjp'g^SC^e Schema: Z = 1 deeltje Zoutsolutie. 2 S = 2 deeltjes Serum verd. 1:10, 1:20 enz. 1°. Breng eerst in Buisje 2, 3, 4, 5 twee deeltjes NaCl. 2°. Vervolgens in Buisje ser. 1:10 = 1 deeltje geïnactiveerd Serum + 9 deeltjes NaCl } Hevel daartoe eerst 9 dl. Zoutsolutie in pipet. Laat Kolom 1 deeltje opglijden (zie pag. 150 onder VI). Sluit pipet van boven af, breng deze in Serum-buisje. Hevel nu 1 deeltje Serum in, door pipet tc kantelen. (de opglijdende kolom trekt het ser. deeltje achter zich aan). Laat geheele hoeveelheid in buisje Ser. 1:10 uitloopen, blaas het laatste er uit. Meng goed met pipet. 3°. Neem uit Buisje S 1:10 = 9 deeltjes1 hiervan) 2 deeltjes in buisjes 1 (2 „ 2 Deeltje 9 wordt weggeblazen, dit heeft gediend als ƒ 2 „ 6 „extra-deeltje" (pag. 152). J 2 „ 7 (c) 4°. Uit Buisje 2 = 2 deeltjes overbrengen in Buisje 3 j ^^pipet^" 3 = 2 4 ' ft »> a a a u » ^ j m a 4 — 1 5 ^ » » 7 ~ A »> ff ff ft j " " „ „ 5 = 2 „ uitnemen en wegblazen. Neem hierbij telkens de resp. buisjes in de hand. In ieder buisje blijven dus over 2 deeltjes der respec. Serumverdunningen. Eerst 24 uur bij 370 c.; dan 24 uur bij Kamer-temp. E?2(B> = 1 deeltie Cholest. | A(B) 12:100 N S ) t. 10 ƒ = 2 deeltjes Norm. ser. verd. 1:10 Verklaring L S ) der 1 • 10 ( = 2 deelties Luetisch ser. „ 1:10 Teekens S x ] 1 -10 f =2 deeltjes Pat. ser. X „ 1:10 ALC 6 = 1 deeltje Alcoh. Zoutsolutie 6 X verd. + = „uitvlokking" = 0.2 ± = zwak „ — o.l — = geen „ = 0.0 5°. Voeg nu toe telkens 1 deeltje van het respec. Extr. Cholest. mengsel. Buisje 1-2-3-4-5 j Cholest. A , ) 1 deeltje » 0 | Extr. Cholest. B 7 (controle) ^ ;eel^e> v / / » « » | Alcohol-Zoutsol. 1:5. 6°. Meng door buisjes leder afzonderlijk te schudden. Vloeistof moet „opalescent" zien. 7°. Buisjes dicht kurken, vooral zorgvuldig. Anders ontstaan er „onspecifieke" reacties door het verdampen van vloeistof. Proef 24 uur bij 37° C. Daarna 24 uur bij Kamer-temp. Het Aflezen der Proef. Plaats Kunst-lichtbron vlak voor Agglutinoscoop. 1°. Schuif ieder buisje in den Agglutinoscoop (C), breng vloeistof in het gezichtsveld, en houdt buisje op de goede plaats, door aan de andere zijde van het Instrument een groote reageerbuis te schuiven (bodem naar buisje toe B). 2°. Zoek de juiste verlichting met spiegel (geringe „donkerveld-werking" door middel van zwart schermpje A) en lees het resultaat af. „vlokvorming" = + krijgt een waarde van 2/)() „zwakke" „ = ± » >> » » '/10 „geen" „ = — .. » » °/io Zie voor beoordeeling der „vlokken" pag. 244. Reeks I = Normaal Serum = 5 ■— Reeks li = Luetisch Serum = 4J4 + Reeks lil = Patienten ser. X = 4 + _ c i ,n i Alcoh. | mag geen II Zoo ja, dan is het ser. Controle = $er. 1:10 r. voor de S.G. reactie niet Zoutsol. | uitvlokking geven || bruikbaar. Zijn de „Controles" niet intact, zoo is de proef waardeloos. 5 x o.o = S.G. °/,0 (negatief) X 0.2 = S.G. °/i0 (sterk positief) 4 x o.2 = S.G. 8/,0 (positief) Theorie der Reactie: Omtrent de theoretische grondslagen van deze reactie is nog zoo goed als niets met zekerheid bekend. Op pag. 234 werd het principe in hoofdzaak besproken en het is duidelijk gebleken dat deze reactie behoort tot het gebied der „Colloïdchemie". De Reactie van Sachs-Georgi hangt in hooge mate af: 1°. Van de mate van Cholesterineering van het Extract. 2°. De snelheid waarmede het Extract 6 X wordt verdund. 3o. De tijd die verloopt tusschen: a. het oogenblik van verdunnen van het Extract en b. het samenbrengen van het Extract met het Serum. 40. De tijd die verloopt tusschen: a. het Inactiveeren van het Serum b. het samenbrengen van het Serum met het Extract. 5o. De juiste temperatuur waaraan de reactie wordt blootgesteld. 6°. Het aflezen in den Agglutinoscoop. Deze feiten alleen zijn reeds voldoende, om ook voor deze reactie de groote „labiliteit" aan te toonen en die haar wel haast dadelijk het karakter ontnemen van een vereenvoudigde, gemakkelijker uitvoerbare Syphilis-reactie te zijn, zooals Sachs en Georgi haar oorspronkelijk voorstelden. De reactie behoort uitsluitend in het Laboratorium thuis en nog wel bij hen, die haar door een langdurige ervaring, bedreven techniek enz., volkomen beheerschen. De groote moeielijkheid en het eigenlijk „beslissende" van deze reactie ligt in het juist standariseeren (cholesterineeren) van het Extract, waarvoor geen enkele theoretische basis aanwezig is, alleen en uitsluitend de „empyrie" de leiding heeft. De Indices werden door Vitringa zoo gekozen, dat zij vergelijkbaar zijn met die van de reactie van v. Wassermann. De reactie van Sachs-Georgi kan en mag de Wa-reactie niet ververvangen, doch moet steeds naast deze worden toegepast. De S.G. geeft in ± 91.4 o/0 overeenstemming met de Wa-reactie. De resteerende 8.6% = De S.G. schiet te kort bty: (in den \ eersten I tijd ' Dementia Paralytica I in alle Lumbaal vocht stadia I der Lues De Wa-react. heeft een voorsprong by: (in den \ eersten I tijd / Dementia Paralytica | in alle Lumbaal vocht stadia | der Lues Over het algemeen is de Wa-reactie iets meer alleen (geïsoleerd) positief dan de S.G.-reactie. Waar echter is gebleken, dat bij sommige gevallen: de S.G. -f- I bij hetzelfde de Wa — serum kan zijn, en omgekeerd, en dat zoo wel een geïsoleerd positieve Wa-reactie, als een geïsoleerd positieve S.G.-reactie, waarde voor de diagnose kunnen hebben, is het voor een juiste serologische diagnose zeer wenscheltfk, zoo niet noodzakelijk, beide reacties naast elkaar te verrichten. Het Bloedpraeparaat. (Malaria-plasmodiën, Spirochaeten, Trypanosomen, Bacteriën, Bloedcellen, enz., enz. (I. Vaccfno-style van Mareschal (zonder gleuf) l) b. Zeepspiritus (of zeep en water). C. Alcohol 96 % d. Aether. e. Watten. Laat deze te voren ƒ. Ontvette objectglazen siOÏJf!SSo}1 met J j & alcohol 96 % ver¬ tikaal staan. g. Objectglazen met „geslepen" randen. h. Dekglazen 18 mM. □ || °0^Ug6% || Utensiliëtl: j. Linnen lapje (zakdoek). j. Bakje waarin de praeparaten in de lengte op hun kant staande, kunnen worden gefixeerd (in den handel). k. Schaaltje waarin de praeparaten kunnen worden gekleurd, en wat gesloten kan worden (b.v. groote Petri'sche schaal). Leg op bodem 2 glazen staven (desnoods 2 potlooden), waarop de praeparaten kunnen worden gelegd (zie teekening). I. Maatglaasje van Voor het mengen en II pl.m. 10 ccm. opdruppelen der Vooral wijd kleurstof. m. Filtreerpapier. II. Aqua Destillata. II Vooral niet zuur rea- II || geerend (^zie verder). || Al het glaswerk, enz. enz., dat voor het „Bloedpraeparaat" wordt gebruikt, moet uitermate zuiver en rein zijn, en geen spoor zuur bevatten. Het gereedmaken van Object- en Dekglazen. Het „gewone" (grove) objectglas wordt voor het eigenlijke praeparaat gebruikt. Het „geslepen" objectglas wordt voor het uitstrijken van den bloeddruppel gebruikt. 1) In den handel j Verkrijgbaar bij 100 Ex. in doosje I Firma Salm Amsterdam. Voor het ontnemen van Bloed. Voor het uitstryken van den Bloeddruppel. i Voor het l fixeeren van het I Bloedpraepar. Voor het kleuren van f het Bloedpraeparaat. Het glas waarmede wordt uitgestreken moet liefst smaller zijn dan het glas waarop wordt uitgestreken. Men bereikt dit op eenvoudige wijze, door het „geslepen" objectglas smaller te maken. Door middel van glas-snijder wordt een hoek van het glas afgebroken, zoodat een kortere zijkant (A) ontstaat. Het „dekglas" wordt voor het levende praeparaat of voor eventueele insluiting van het droge praeparaat gebruikt. Object- en Dekglazen welke voor het bloed-praeparaat worden gebruikt, moeten uitermate rein zijn (stof- en vetvrij). 1°. Haal de objectglazen (2 per patiënt) uit den alcohol, houdt deze met pincet even in de vlam (afbranden der alcohol) en wrijf ze voorzichtig na met linnen lapje. De dekglazen kunnen niet worden afgebrand (springen); men wrijft ze voorzichtig met linnen lapje tusschen twee vingers af. (Vooral nooit hard afwrijven, het glas wordt dan electrisch en trekt duizende stofjes aan). De op deze wijze gereinigde glazen zijn voldoende vet- en stofvrij. Voor transport wikkele men de goed gereinigde glazen in „filtreerpapier". /ie voor het „merken" der praeparaten pag. 257. 2°. Leg de glazen vlak neer, met de gereinigde zijde naar boven, zoo dat men ze gemakkelijk kan grijpen, dus met de randen over de tafel heenstekende. Op deze wijze kan men gemakkelijk de tegenovergestelde glasranden tusschen duim en wijsvinger nemen. (Neem nooit het glas zelf tusschen de vingers.) Het Ontnemen van Bloed: Aangewezen plaatsen : /-» _ fzeer bloedrijk \ Oorlelletje _ ^ameijjk ongevoelig/ Volair-zijde Vingertop = (zie pag. 160 van 4» tot 7») Plantair-zijde Groote Teen I 0f J. = Bij kleine kinderen. Hiel J 1°. Desinfecteer lancet met alcohol en aether (flink afwrijven). „ de huid „ zeep en water, daarna met alcohol en aether (flink afwrijven) en laat goed drogen. 2°. Neem oorlelletje tusschen duim en wijsvinger, knijp een weinig en steek lancet in den rand van het „lelletje", Iaat deze er even in en haal dan terug. Indien men in het „platte" deel van het „lelletje" steekt, is het gevaar groot er door heen te steken, en de „daaronder" liggende vinger te verwonden (infecteeren! Spirochaeten-ziekten enz. enz.) Den eerst afvloeienden druppel gebruikt men niet, wrijf deze af met watten. De volgende bloeddruppels zijn voor het onderzoek te gebruiken: (raak vooral de huid nooit aan, alleen den bloeddruppel). Vloeit er zoo goed als geen bloed af, dan mag nooit, indien er tenminste tevens een bloed formule moet worden gemaakt, door druk of knijpen (stuwing), meer bloed worden verkregen. Veeg daartoe wondje en omgevende huid flink met aether af; dikwijls komt er dan door de ontstane vaatprikkeling meer bloed; is dit toch niet het geval, dan moet tot een nieuwe incisie worden overgegaan. Na afloop kntfpt men het „wondje" tusschen watten dicht en laat er wat pluksel aanhangen. De „vaccinostyle" wordt óf weggegooid, óf afgeveegd met alcohol of carbol (watje) en kan dan wederom dienst doen. Het „levende" Bloed-praeparaat. 1°. Neem de tegenovergestelde randen van het dekglas tusschen de vingers. 2°. Raak met dekglas (midden), den afvloeienden bloeddruppel even aan en laat het dekglas meteen op objectglas (midden) vallen (vooral niet aandrukken). Het bloed moet zich gelijkmatig onder het dekglas verspreiden. Het dekglas mag niet op het bloed „drijven" (druppel te groot). Desnoods randen van dekglas omgeven met vaseline om de verdamping tegen te gaan. 3 . Dadelijk microscopisch onderzoeken (zie pag. 63). Men behoeft hier niet Mo voorzichtig in te stellen, aangezien het geen „Hangende druppel" is tafel (370 CT'g 0nderzoek' Iegge raen het Praeparaat op „verwarmde" object- Het „gekleurde Bloed-uitstrijkpraeparaat. Het uitstrijken. 1°. Neem tegenovergestelde randen van objectglas tusschen de vingers. 2°. Raak nu met objectglas (uiteinde) den afvloeienden bloeddruppel even aan en strijk deze nu met korten kant van „geslepen" objectglas gelijkmatig en snel uit, nadat eerst duidelijk voeling (contact) tusschen glasrand en druppel is verkregen (zie fig.). Vooral „zonder onderbreking" uitstrijken; horten en stooten geven slechte praeparaten. Voor meerdere praep. na elkaar, telkens wondje er tusschen goed reinigen (met watten afwrijven) en verschen bloeddruppel bezigen. Men vege rand van „geslepen" objectglas voor ieder nieuw praeparaat telkens goed af, of neme telkens een nieuw glas. Van iederen patiënt worden „minstens" 2 praeparaten gemaakt. Wanneer de bloeddruppel goed is uitgestreken, moet het praeparaat eruit zien, alsof het objectglas door een dun gelijkmatig vllesje is bedekt, waarin de bloedcellen fraai „geïsoleerd" te zien zijn (dit eerst door veel oefening). Bij gebrek aan „geslepen" objectglazen voor het uitstrijken, kan men ook heel goed slap carton (briefkaart, visitekaartje) gebruiken. Met deze uitstrijk-methode beschadigt men de bloed-elementen het minst, daar de druppel achter den rand van het objectglas aan, (door Capillariteit) wordt voortgesleept, zonder dat er in het minst op de bloedcellen wordt gedrukt. Anaemisch-Bloed. Bij zeer anaemisch bloed (waterachtig) doet men goed, den bloed-druppel andersom uit te strijken, dus van links naar rechts. De veel schaarschere bloed-cellen worden dan meer opeengehoopt en zijn daardoor beter zichtbaar. Het drogen. 3°. Laat de praeparaten aan de lucht goed drogen, en wacht daarna nog + 5 min., alvorens tot de eigenlijke kleuring over te gaan. Het „merken" der Praeparaten. A Etiketje (aan uiteinde) opplakken, met Canadabalsam door Xylol verdund (onoplosbaar in alcohol, aether, enz. enz.) B Met „glaspotlood" op de gewone wijze, het objectglas beschrijven. Om dit houdbaar te maken (bij later kleuren en spoelen) houdt men dit in de vlam, totdat de kleur van het potlood „zwartachtig" wordt (Wright) Dit te doen voor dat het praeparaat wordt gemaakt (beschadiging der bloedcellen, door te groote verwarming). Het bewaren van „ongefixeerde" B1 oed- uitstrijkpraeparaten. Wil men nog niet tot kleuring overgaan, zoo wikkelt men de goed droge, doch ongefixeerde praeparaten in filtreerpapier en sluit ze weg in stopflesch, waar op bodem Chloorcalcium (overdekt met filtreerpapier) of Chloorcalcium in hollen stop. (Zorg vooral dat de praeparaten nooit met het Chloorcalcium in aanraking komen.) Ten overvloede kan men nog tusschen 2 praep. 2 lucifers overlangs aanbrengen om de praep. zijden van elkaar te scheiden en hen dan zoo in papier wikkelen. Het Fixeeren. Dit is alleen noodig voor praeparaten die met kleurstof A en G worden behandeld overbodig is het voor de kleurstoffen B, C, D, E en F, aangezien daar de fixatie vloeistof (Methylalcohol en Aceton) reeds in de kleurstof aanwezig is. 4°. Fixeer nu de goed droge praeparaten in: Methylalcohol ± 3 a 5 min. of Absolute Aethylalcohol ± 15 a 20 min. In gesloten of bakie Absolute Aethylalcohol-Aether 'aa . ± 10 a 15 min. Fixeer vooral nooit in de vlam, de bloedcellen worden dan zeer geschaad. 5°. Laat de praeparaten goed drogen, eerst vertikaal laten afdruipen op filtreerpapier en dan den alcohol rustig laten verdampen. De fixatie-vloeistoffen kunnen meermalen worden gebruikt, mits zij in goed gesloten stopflesschen worden bewaard. Algemeene Wenken voor Kleuring enz. I. Het Glaswerk moet volkomen rein en zuiver zijn (geen spoortje zuur bevatten, anders mislukt de kleuring). Hierop Streng te letten. II. Het Aqua Dest. moet absoluut zuur„vrij" zijn. De geringste sporen zuur (niet eens aantoonbaar door lakmoespapier, Lucht-Co2) kunnen de kleuring doen mislukken, door Azuur-Eosine „neer te slaan". Voor het aantoonen der Maurer'sche „vlekken" en Schüffner'sche „stippeling" (Malaria), verdient het aanbeveling het neutrale Aqua Dest. Alkalisch te maken: 20 ccm. Aqua Dest. + 14 2 drupp. Na2Co3 1:100. Keuring van het Water-monster. Leiding-water zal zelden bruikbaar blijken (Anorgan. zouten, enz. enz.). Reagens Methode Haematoxyline KI uur Eenige cristallen Versch ,0 ccm- van■ J"4 Water bl1 (met pincet^ aanvatten) bereiden 3_5 Drupp. Haematoxyl opl. ijcht-geel" 5 ccm. Alcohol 96 % Resultaten: A = Binnen 1 minuut Violet = te Alkalisch. B = Tusschen 1-5 „ „ = Neutraal C = Na 5 „ „ = Zuur. Door „uitkoken" van het Water (5 è 10 min.) laat het zuur zich dikwijls reeds verwijderen, anders voorzichtig bijdruppelen van 1 % Na2Co3) en wederom reactie bepalen als boven (stam-voorraad maken). Zuiver opgevangen Regen- of Sneeuwwater bruikbaar, doch na „uitkoken" en filtreeren. III. De Kleurstoffen (standaard-oploss. enz.) moeten goed afgesloten in donker worden bewaard (voor licht beschutten) „verdunde" oplossingen telkens opnieuw maken even voor het gebruik, in „chemisch-zuiver" glaswerk, met „chemisch-zuiver" water. Mislukkingen zijn meestal te wijten aan: lo. Slechte standaard-oploss. (van verkeerde Fabrieken). 2o. Chemisch onzuiver Water en Glaswerk. 3°. Het maken van te groote quantiteiten Kleurstof tegelijk (niet meer dan 20 ccm.) 40. Te dunne maatglazen (minstens 2% cm. diam.) 5°. Onnoodig lang mengen; dit moet voorzichtig en langzaam geschieden. 60. Nooit glaswerk gebruiken waaraan ook maar „spoortje" oude kleurstof kleeft. 70. Tusschen het „verdunnen" der Kleurstof en het „opdruppelen" op het praep. mag zoo goed als geen tijd verloopen. Kleurstoffen en Methoden van Kleuring. Men rekene per praep. op 3—5 ccm. Kleurstof. Onderstaande kleurstoffen zijn alle derivaten der oorspronkelijke Romanowskykleurstof (Eosine-Methyleenblauw); zij geven de beste en chromatisch meest gedifferencieerde resultaten. A. Chromatin-kleurstof II — Eosine 3.- gr. fMethyleen azur} Chloorhydraat Verkrijgbaar volgens bij Firma Azur II < 3 3 ■ Dr. Grübler Methyleen- 0.8 gr. Kronprinzstr. 71 „Giemsa" ') blauw te Leipzig, als Chloorhydraat „Giemsa-lösung fur die Glycerine Merck. J 125- gr. Ro™anowsky |Chem. zuiver ( farbung". In donker bewaren (in het licht dissocieert de Methyl- ) v ... ,1 kleurstof). alcohol } Kahlbaum I J 375.- gr. Voor het oplossen eerst het Aqua Dest. en daarin de kleurstof opvangen. 1 ccm Aqua Dest. + 1 druppel „Giemsa" (met pipet) 1 Even voor de 0f J. eigenlijke 9 ccm Aqua Dest. + 1 ccm „Giemsa" (met pipet) ) sam^nstelfen. Meng dit voorzichtig door heen en weer zwenken van het maatglas. Het praeparaat moet hier vooraf wel worden gefixeerd (zie pag. 257). Voor Spirochaeten (b.v. Pallida) moet de kleuring met kleurstoffen A en B worden uitgestrekt tot 1 è 2 uur, soms nog langer. Het verdient aanbeveling tot bespoediging der kleuring in die gevallen wat Alkali bij de kleurstof te voegen b.v.: Voeg bij 10 ccM. van het Aqua Dest. 5 a 10 druppels eener 1°/oo Kaliumcarbonaat oplossing. Kleuring. Druppel uit maatglaasje Kleurstof A op het gefixeerde praeparaat en laat inwerken ± 15 k 30 min. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. 1) Giemsa. Centralbl. für Bact. Abt. I Orig. Bd. 37 1904. » ,, I „ „ 89 1923. „ I „ „ 91 1924. v. Schilling. Das Blutbild und seine Klinische Verwertung, Gustav Fischer, Je na 1924. Het afspoelen en drogen. Spoel nu 1 praeparaat voorzichtig onder den waterstraal kort af, droog tusschen schoon filtreerpapier en onderzoek microscopisch, desnoods eerst met „droog systeem", sterkste Objectief + Ocul. 4. Blijkt de kleuring voldoende te zijn, dan spoele- en droge men de overige praeparaten op dezelfde wijze; is zij niet voldoende, dan late men de praeparaten langer kleuren en controleert ze dan microscopisch, na verschillend tijdsverloop, een voor een. Voor het Microscopisch onderzoek en het Bewaren en Insluiten der Praeparaten, zie pag. 54-55. B. Kleurstof volgens „Kiewiet de Jonge". ')j ^°™bler) ™ m*r- Gewijzigde Oiemsa'sche Kleurstof J Methylalcohol . 25 „ Voor „dikke druppel" 1 ccm. Aqua Dest. + 5 drupp. Kleurstof. Het praeparaat behoeft hier vooraf niet te worden gefixeerd. Kleuring. Druppel uit maatglaasje afgemeten hoeveelheid Kleurstof B op het ongefixeerde praeparaat en voeg er dadelijk evenveel Aqua Dest. (uit ander maatglaasje) aan toe; meng dit door met pipet lucht over het praeparaat te blazen, en laat inwerken pl.m. 15 a 30min. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. | „Giemsa'sche kleurstof" C. Snelkleurstof volgens „Giemsa"2) + Aceton puriss. De praeparaten mogen voor deze kleurmethode In goed afgesloten niet ouder zijn dan 2X24 uur. flesch lang te bewaren. Het praeparaat moet hier vooraf niet worden gefixeerd. Kleuring: Druppel uit maatglaasje 20 druppels Kleurstof C op het ongefixeerde praeparaat en laat inwerken pl.m. 2 min. Voeg daarna 10 ccm. Aqua Dest. (uit ander maatglaasje) toe, meng dit door met pipet lucht over het praeparaat te blazen. laat inwerken pl.m. 6 a 10 min. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. 1) Kiewiet de Jonge. Tropische Ziekten v. d. Indischen Archipel, deel I. 2) v. Schilling. Das Blutbild und seine Klinische Verwertung. Jena 1924. D. Gecombineerde kleurmethode „Giemsa, May-Griinwald" volgens Pappenheim. ') I Kleurstof van May-Grünwald 1 Eosine-Methyleenblauw J * ) in Methyl-Alcohol Verkrijgbaar in Tabletvorm bij Dr. Grübler te Leipzig. Oplossen • \ 1 Tablet fijnwrijven in mortier, in flesch overstorten en toevoegen ƒ 100 gr. Methyl-Alcohol (Chem. zuiver). Goed schudden tot oplossing. Filtreeren en bewaren in flesch met caoutchouc kurk afgesloten (in het donker). II Kleurstof „Giemsa Alt" of „Giemsa Neu". Op het Etiket van Kleurstof-fleschje „Giemsa" staat een getal gestempeld, 3 a 4 cijfers groot, welke de datum der bereiding aangeeft. Het eerste of de 2 eerste cijfers beteekenen de maand, de laatste cijfers het jaar der bereiding, b.v. 0 2 2 0 1 2 1 9 II II •s/* V/- Febr. 1920 Dec. 1919 (Giemsa Neu) (Giemsa Alt) Voor de kleuring oplossen in rein maatglaasje: 10 ccM. Aqua Dest. + 2 ccM. Giemsa „Alt" (met pipet) , Even voor 1 de eigenlijke 10 ccM. Aqua Dest + 3 ccM. Giemsa „Neu" (met pipet)) samenvoegen. Kleuring: Praeparaat niet vooraf fixeeren. 1°. Druppel uit maatglaasje afgemeten hoeveelheid kleurstof May-Grünwald (I) op ongefixeerd praeparaat en Iaat inwerken 3 min. 2°. Daarna toevoegen evenveel Aqua Dest. (uit ander maatglaasje) meng dit door met pipet lucht over praep. te blazen en laat inwerken 1 min. 3°. Kleurstof afgieten, niet spoelen. 4°. Opgieten „Giemsa oplossing" (II) en laat inwerken 15 a 20 min. 5°. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. 1) A. Pappenheim. Grundriss der Hamatologischen Diagnostik und Praktischen Blutuntersuchung Verlag Klinkhardt, Leipzig 1911. {Giemsa „Alt" 1 ccM. of Giemsa „Neu" 1.5 ccM. May-Grünwald 1 ccM. oploss. pag. 261 Aceton Puriss 0.2 ccM. (Merck of Kahlbaum) Even tevoren bereiden in rein maatglaasje. Kleuring: Praeparaat vooraf niet fixeeren. 1°. Druppel afgemeten hoeveelheid Kleurstof E uit maatglaasje op praeparaat en laat inwerken (fixeeren) 3 min. 2°. Daarna toevoegen evenveel Aqua Dest (uit ander maatglaasje), meng dit door met pipet lucht over praeparaat te blazen, en laat inwerken 12-14 min. 3°. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. _ , . . . . , „ 1 Eosine-Methyleenblauw F. Kleurstof volgens „Le.shman J jn Methylalcohol Verkrijgbaar in Tabletvorm bij Dr. Grübler te Leipzig. }1 Tablet fijnwrijven in Mortier. In flesch overstorten en toevoegen 100 gr. Methylalcohol. (chem. zuiver). Goed schudden tot oplossing. Filtreeren en bewaren in flesch met Caoutchouc Kurk gesloten. Kleuring : Praeparaat niet vooraf fixeeren. 1°. Druppel uit maatglaasje afgemeten hoeveelheid Kleurstof F op ongefixeerd praeparaat en laat inwerken 1 min. 2°. Daarna toevoegen 2 X zooveel Aqua Dest. (uit ander maatglaasje). meng dit door met Pipet lucht over praeparaat te blazen en laat inwerken 5 min. 3°. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. G. „Enkelv. kleurstof" Borax .... 5 gr. Eerst de Borax in het kokende Aqua vnlcfpn^ Methyl. Blauw 2 gr. Dest. Vervolgens ' Med. pur. Höchst. ^et Methyl. Blauw. Aqua Dest. 100 ccM. Oploss. ± 6 weken "ManSOn (Kokend) houdbaar. Voor de Kleuring, kleurstof met Aqua Dest. verdunnen (in maatglaasje) totdat de oplossing even doorschijnend is. Kleuring: Praeparaat vooraf wel fixeeren. 1°. Druppel uit maatglaasje Kleurstof G op het gefixeerde praeparaat en laat inwerken 10 a 15 sec. 2°. Afspoelen, drogen en bekijken, zie pag. 260. Na kleuring heeft praep. mat groene tint (Ervtrocyten). „Dikke druppel" methode tot het opsporen van enkele parasieten in het Bloed, volgens Ross. ') Voor deze methode mag het Bloedpraeparaat in de Tropen niet ouder zijn dan 24 uur, anders fixeert het vanzelf. 1°. Breng grooten, dikken bloed-druppel op objectglas; strijk deze nu heel weinig uit (14 2 cM. breed), zoodat er een dikke bloedlaag op het objectglas ligt (zie „stippellijn" fig.). Bij deze methode moet men vooral zorg dragen bij het opvangen van het bloed, de huid nooit aan te raken; raak dus den afvloeienden druppel even met objectglas aan, het praep. wordt anders verontreinigd en is onbruikbaar. 2°. Laat praeparaat goed drogen (liefst 24 uur). 3°. Er wordt nu niet gefixeerd, maar volgende sterk verdunde Giemsa-oplossing op het praeparaat gedruppeld: 1 ccm. Aqua Dest. + 1 druppel „Giemsa", laat inwerken ± 5 min. Na enkele min. vermengt zich met de kleurstof, een van het praep. afkomende groen-gele „wolk"; dit is Haemoglobine, en het bewijs dat de „haemolyse" heeft plaats gehad. Giet kleurstof af en druppel nu een nieuw gemaakte hoeveelheid = 2 ccm. Aqua Dest. + 1 druppel „Giemsa" op het praeparaat en laat inwerken 3/4al uur 4°. Spoel nu niet onder den waterstraal (het praeparaat zou worden weggespoeld), maar voorzichtig in schaaltje met water. 5°. Droog niet tusschen filtreerpapier, maar laat praeparaat vertikaal op filtreerpapier uitdruipen en drogen. 1) R. Ross. Centralbl. für Bact. Abt. I. Ref. Bd. 36, 1905. v. Schilling. Anleitung zur Diagnose im dicken Bluttropfen. Gustav Fischer. Jena 1924. Theorie van deze methode. Voor het opsporen van heel enkele parasieten is het onderzoek eener groote hoeveelheid bloed, die gemakkelijk kan worden overzien, noodzakelijk; vandaar het „dikke druppel" praeparaat. Door de inwerking der sterk verdunde Giemsa'sche kleurstof, treedt het „Haemoglobine" uit de ongefixeerde erythrocyten (Haemolyse), waardoor de bloedlaag doorzichtig wordt. De enkele parasieten die nu ook tevens gekleurd zijn geworden, zullen den onderzoeker nu, omdat de „dikke druppel" doorzichtig is geworden, niet licht ontgaan. Theorie der Methoden: Het „levende" Bloedpraeparaat. Het „levende" Bloedpraeparaat wordt in hoofdzaak vervaardigd om de verschillende soorten van beweging der elementen (bloedlichaampjes) en parasieten te kunnen bestudeeren. (Voor Trypanosomen — Spirochaeten — Plasmodiën — zeer typisch). Het „gekleurde Bloed-uitstrijkpraeparaat". Het „gekleurde" Bloed-uitstrijkpraeparaat heeft practisch de grootste waarde: 1°. Voor het diagnostiseeren van Bloedziekten (samenstellen der bloedformule). 2n. Voor het aantoonen van Parasieten (Malariaplasmodiën — Trypanosomen — Spirochaeten, enz., enz.) die zich met de tegenwoordige „polychromatische" bloedkleurstoffen bijzonder contrastrijk en fraai kleuren. De Bloed-kleurstoffen zijn zoodanig samengesteld, dat zij uit verschillende kleurende komponenten bestaan, minstens uit 1 basische kleurstof (Methyleenblauw — Methyleengroen — Amethystviolet — Pyronin enz.) en 1 zure kleurstof (Eosine — Oranje — zure Fuchsine — Narcëine, enz.), waarvan de Chemische samenstelling een zoodanige is, dat de kleurstof „neutraal" is. De Bloedelementen in het algemeen (normale en pathologische), en parasieten enz. vertoonen een zeer verschillende affiniteit ten opzichte van deze kleurstofkomponenten, zoodat de fraaiste en meest contrastrijke differenciaties ontstaan. Alles wat zich nu met den Basischen komponent kleurt heet Basophiel i Acidophiel „ „ „ „ „ „ Zliren „ » » ' Oxyphiel f Eosinophiel „ „ „ Neutralen „ „ „ Neutrophiel (tusschenkleur) De Giemsa'sche kleurstof is een volmaking der oude Romanowsky'sche kleurstof, welke in hoofdzaak een mengsel is van Eosine (Zlllir) en Methyleenbiauw (basisch). Romanowsky zag nu, wanneer hij Eosine en Methyleenblauw in bepaalde verhoudingen mengde, dat er een „nieuwe kleurende komponent" ontstond welke het Chromatine (kernsubstantie) zeer fraai rood kleurde, n.m. het „Rood uit Methyleenblauw" (Azuur). (Dit „Rood uit Methyleenblauw" ontstaat ook, wanneer bij Methyleenblauw Alkali wordt gevoegd „Loeffler's Methyleenblauw", zie pag. 70). In de Romanowsky'sche kleurstof zyn dus de volgende kleurstof komponenten aanwezig: Methyleenblauw — BdSOphiel (Blauw) Eosine . . . — Acidophiel (Rood) Eosinezuur-Methyleenblauw Neutrophiel (Violet) „tusschenkleur" „Rood uit Methyleenblauw" = Chromatinophiel (Rood) (basisch). Giemsa heeft nu de groote verdienste gehad, het z.g. „Rood uit Methyleenblauw", dat door Michaelis was vastgesteld als Methyleen-Azuur, Chemisch zuiver te bereiden: Azuur i Methyleen Azuur-chloorhydraat. — Methyleen Azuur-chloor hydraat. | Azuur II -f- \ aa Methyleen l$\dL\\w-chloorhydraat. f Dit Azuur II vermengde hij nu met Eosine, Methylalcohol en Glycerine,zie pag.259. Door deze wijze van bereiden is de kleurstof van veel constanter samenstelling geworden en worden daardoor ook veel regelmatiger resultaten bij de kleuring van het bloed verkregen, dan vroeger het geval was. In hoofdzaak verhouden zich nu de kleurstof komponenten dezer „Giemsa'sche" oplossing van de Romanowsky-kleurstof als volgt: Methyleenblauw. , . . . . - : Basophlel (blauw). Eosine Acidophiel 1 Eosinophiel ƒ (rood)- Methyleen Azuur Chromatinophiel (rood). (basisch) Eosinezuur-Methyleenblauw. Neutrophiel (violet). Eosine-Methyleenblauw-Azur oefenen op elkaar een eigenaardige „bijts-werking" uit en geven de zuiverste differenciaties, wanneer zij in „neutrale" oplossing gebruikt worden. Dan eerst zijn de cel-bestanddeelen, met haar zeer verschillende, subtiele, fijn , gebalanceerde electiviteit. in staat, die kleurende Componenten tot zich te trekken, waartoe zij een verhoogde „affiniteit" bezitten. Is de oplossing „zwak zuur", zoo overwegen dadelijk de Acidophiele Componenten (Eosine); is zij „licht Alkalisch" zoo overweegt het Azur (basisch) (denk aan Aqua Dest.! pag. 258). Het typische „rood" waarmede zich de Kernsubstantie (Chromatine) zoo fraai kleurt, is een gecombineerde werking van Azur en Eosine. Noch Azur, noch Eosine alleen zijn daartoe in staat. Het Azur dat eerst wordt opgenomen, kleurt de kern „metachromatisch" (blauwroodviolet, zie nog pag. 17), doch fungeert tevens als „bijts". Het geeft m.a. w. die physisch-chemische „omvorming", die het mogelyk maakt, dat het Eosine, waartoe het weefsel anders zoo geringe affiniteit bezit, die fraaie „rood-kleuring" geven kan (zie nog pag. 19). Het Methyleenblauw heeft geen aandeel aan deze „rood-kleuring". Het geeft echter een veel dieper blauw, dan het „metachromatisch" kleurende Azur in staat zou zijn te geven; het geheele weefselbeeld wordt daardoor nog duidelijker gedifferencieerd (Giemsa). Bloedcellen en Parasieten kleuren zich nu met „Giemsa" als volgt: Erythrocyten = Bleekrood. Kern . — Rood tot Violetrood. Neutrophiele Polynucle- Protoplasmaaire Leucocyten . . . korreling . = Violetrood. (fijne korrels) Kern . — Rood tot Violetrood. Eosinophiele Polynucle- Protoplasma- aire Leucocyten . . . korreling . — Rood tot Bruinrood. (grove korrels) Kern. . . — Rood tot Violetrood. Basophiele Polynu-lMest- Protoplasma- cleaire Leucocyten|ce"en korreling . — Blauw tot Biauwviolet. (grove korrels) (metachromatisch). Kern . = Rood tot Violetrood. Lymphocyten enj i kleine i Protoplasma — Blauw met Azuurkorreling (rood). Groote Mononucleaire Kem = Rood tot violttrood. Leucocyten en Overgangscellen . . Protoplasma — Blauw met füne Violetroode ° & r (Neutrophiele) korreling Centrum = Rood. Bloedplaatjes .... Peripherie — Blauwachtig. Kernsubstantie .... , .... (Chromatine) = Rood. Malar.a-plasmod.en . . Protoplasma = Biauw. Pigment . — Bruinzwart. Kern. . . — Rood. Trypanosomen .... Blepharoplast= Rood. Zweeparaaa — Rood. Protoplasma — Blauw. . Bleekrood (Spir. Pallida) tot Sp.rochaeten Biauwviolet. Bacteriën || Rood tot Biauwviolet. INHOUD. Bacteriologische-Methoden. Reïn-Cultuur. Pag. Het Overenten op Buizen 3-7 „ „ „ Platen 9 Het Gieten v. Gelatine en Agar-platen 95-98 „ onderzoek v. „ „ „ „ 98-102 Enting op „oppervlakte" v. Agar-plaat 102-104 Gebruik „steriele" Pipet 10-12 Schrijven op Glas 8 Praeparaten. Het eenvoudige Uitstrijk-Praeparaat . 53 Bewaren en Insluiten van praeparaten 55 De „Hangende Druppel" 60-65 O.-I. Inkt praep. vlgs. Burri 86-90 Zweepdraden, Bacteriën, Spirochaeten in het „donkerveld" 77-86 Sputum-Onderzoek. Sputum onderz., gewoon 69-72 „ „ vlgs Nakao Abe J Sublim. 72 . „ . Loef,er }An«for- 73 Water-Onderzoek. Bacteriologisch Water-Onderzoek . . 104-109 Proef van Eykman j Coli 109-112 Melk-Onderzoek. Bacteriologisch Melk-Onderzoek . . . 112-117 Proef van Ringeling j Coli 117 Katalase Reactie . 118 Storch-Reactie j Peroxydase . .119 Anaeroben. Voorbereiding Materiaal 121-123 Hesse-LiboriusVeillon .... 123-127 Kweek-Methoden Tarozzi .... 128 . ( Wright-Burri . . 131 volgens: „ ® Buchner .... 133 v. Riemsdijk . . 135-138 Klok van Alex. Klein 139 Zuurstof-Indicator vlgs M. v. Riemsdijk 130 „Anaerobe" hangende druppel vlgs M. v. Riemsdijk 141-143 Kleur-Methoden. Kleurstoffen. Pag. Kleurstoffen en Kleuring (theorie enz.) 13-20 Bereiding „Alcoholische" Kleuroploss. 21 „ „Waterige" „ 21 Reiniging handen van Kleurstof ... 21 „ gekleurde Alcoholen , . . 22-24 Gram-praep. „Gram" Kleuring 56 „Massa" Gram-Kleuring 57-60 Zuurvaste Organ. Sporen - Kleuring vlgs Klein .... 68 Tuberkelbac. „ „ Ziehl-Neelsen . 69-72 Spirochaeten. Spirochaeten-Kleuring vlgs Becker- Krantz 90 Pool-Korrels. Pool-kleuring vlgs Neisser (Diphtherie) 74 Kapsels. Kapsel-kleuring vlgs A. Johne ... 76 „ „ „ M. v. Riemsdijk . 75 Ciliën. Zweepdraden-Kleuring vlgs Zettnow 91-95 Bloed. Bloed-Kleuringen (zie onder) .... 253-266 Physische Methoden. Microscoop. Microscoop, theorie enz 27-43 „ gebruik-onderhoud . . , 39-48 \ Zeiss . . 49 „ Vergrootings | Leitz . . 50 tabellen j Reichert 51 J Winkel . 52 Microsc.-Onderzoek. Microsc.-onderzoek „gekleurde" praep. 54 i, „ „on"gekleurde „ 63-65 „Donkerveld"-belichting 77-86 Alcohol. Pag. Reiniging gekleurde Alcoholen . . . 22-24 Bepaling soort, gewicht van Alcohol . 25 Tabel verd. Alcohol met water vlgs Guay-Lussac 26 Anaeroben. Klok van Alex. Klein 139 Chemische-Reacties. Indol-reacties. Indol-vorming 65 \ Ehrlich 66 Indol-reacties | Kitasato-Salkowsky . 67 volgens: \ Dunham-Salkowsky . 67 J (cholera-rood) Ferment-Reacties. Katalase-reactie 118 Peroxydase-reactie j Storch 119 Zuurstof-Indicator. Zuurstof-Indicator vlgs M. v. Riemsdijk 130 Zuurstof-Adsorbtie. Pyrogallol-Kali proeven 131-143 Reactie-bepaling van Aqua Dest. . . 258 Reiniging handen van Kleurstof ... 21 Serologische-Reacties. Instrumentarium. Serologische-gegradueerde Pipet . . . 147-154 vlgs M. van Riemsdijk Buisjes, Rekjes, enz. enz 154-157 Serum. ..... ï Bloedafname bij Mensch 158-162 Verkrllgen \ „ „ Dier. . 163-193 van > vloeibaar" Serum . . . 163 Serum J „Droog" Serum ... 165 L Agglutinatie Reactie. Pag. Agglutinatie \ Macroscopisch .... 167-176 Reactie > Microscopisch .... 177-180 Theorie van het „uitvlokkings" proces 180-184 Proef van Castellani. Adsorbtie van Agglutininen 184-187 Complement-bindings Reactie. Reactie vlgs Bordet-Gengou 188-216 Reactie van v. Wassermann. Reactie van v. Wassermann .... 5-16-234 volgens B. P. Sormani Sachs-Georgi Reactie. Sachs-Georgi-reactie 234-252 vlgs A. J. Vitringa Bloed-Onderzoek. Praeparaten. Instrumentarium 253 Bloed-afname 254 Het „levende" Bloed-praep 255 Het „Uitstrijk" praeparaat 256 De „dikke-druppel" vlgs Ross .... 263 Bewaren van „Uitstrijk"-praep. ... 257 Chemische-keuring van Aqua Dest 258 Kleur-Methoden. v Giemsa 259 Kiewiet de Jonge .... 260 Giemsa, May-Grünwald . . 261 Kleuring vlgs Pappenheim •Giemsa . .} -260 volgens: . . Pappenheim { methode . 262 Leishman 262 Manson 262 Theoretische beschouwing Giemsa- Kleurstof en Kleuring 264-266 DRUKFOUTEN. Bladz. 141 staat: Glasring (klein) doorsnede 22 mM. moet zijn 11 mM. 172 . Gebruik hier de „suspensie" pipet (pag. 49) moet zijn (pag. 147). „ 176 „ bij 1» en 3» zie pag. 80 moet zijn pag. 180.